Box-Behnken,响应面法优化天麻胶囊挥发油包合工艺

刘松鑫，周 娜，庄 园，吴成红，于祥玉，左瑞娟，武光云，卢传广，战瑞雪，关永霞*，沈庆国

（1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；
2.鲁南制药集团中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；
3.临沂大学 档案馆，山东 临沂 276005；
4.临沂市养老事业发展服务中心，山东 临沂 276032）

天麻胶囊由天麻、独活、羌活、盐杜仲、牛膝、粉萆薢、附子、当归、地黄、玄参共10 味药组成，具有活血止痛、祛风除湿的功效[1]。天麻胶囊处方中当归、羌活、独活等多味药材含有挥发油成分[2-4]，具有抗癌、抗氧化、抗炎等药理作用[5-6]。目前，中成药在制剂过程中普遍将挥发油喷入到半成品颗粒中，在这种情况下挥发油极易氧化和散失，且难以保证挥发油在成品中的均一性[7]。研究表明，挥发油经环糊精包合后能使液体药物粉末化，便于制剂，并掩盖不良气味，降低刺激性，同时降低挥发油的氧化，提高其稳定性[8-10]。现在一些中成药也采用挥发油β-环状糊精包合法提高制剂的稳定性[11-12]。因此，本研究拟通过对比饱和水溶液法、胶体磨包合法和超声法包合天麻胶囊挥发油的效果，采用 Box-Behnken响应面法优化胶体磨包合工艺，为天麻胶囊工业化生产提供理论支撑。

1.1 药物与试剂

独活、羌活、当归药材购自宕昌县康兰森中药材有限公司，由鲁南制药集团中药制药共性技术国家重点实验室范建伟高级工程师鉴定均符合2020 年版《中国药典》（一部）规定；
β-环糊精（批号：20211206，孟川市华兴生物化工有限公司）。

1.2 主要仪器

SHIMADZU GC-2030 型气相色谱仪（日本岛津公司）；
JM50AL 型胶体磨（上海力超电机有限公司）。

2.1 挥发油的制备

分别称取独活、羌活、当归药材各7 kg、7 kg、14 kg，按2020 年版《中国药典》（四部）通则“2204挥发油测定法”中甲法提取挥发油[13]，提取得挥发油380 mL，加等量无水乙醇，备用。天麻胶囊挥发油的密度测定按照2020 年版《中国药典》（四部）通则“0601 相对密度测定法”，以比重瓶法测得天麻胶囊挥发油相对密度为0.875 6。

2.2 空白回收率的测定

按“2.1”项下方法量取挥发油乙醇溶液2 mL（相当于天麻胶囊挥发油纯油1 mL），加水500 mL 和适量沸石，保持微沸5 h，测定空白回收率。空白回收率=（挥发油收集量/挥发油投入量）×100%，平行测定3 次后得其数值为（70.00±1.78）%。

2.3 评价指标

在评价挥发油包合效果过程中，包封率和收率是其主要指标，综合多种因素，将包封率权重系数定为70%，收率权重系数定为30%[14]。本实验以天麻胶囊挥发油包合物收率和包封率为评价指标，计算综合分数。包封率Y1=包合物中挥发油量/ （投油量×空白回收率）×100%收率Y2=包合物质量/（β-环糊精质量+挥发油质量）×100%

综合分数Y=Y1/Y1max×70% +Y2/Y2max×30%

2.4 天麻胶囊挥发油包合方式的选择

2.4.1 饱和水溶液法 称取β-环糊精 24 g，加水500 mL（50℃），搅拌10 min，缓慢加入挥发油乙醇溶液6 mL（相当于天麻胶囊挥发油纯油3 mL，以下同），滴加完毕，恒温搅拌包合30 min，静置24 h，抽滤，45℃烘干，备用。

2.4.2 胶体磨包合法 称取β-环糊精 24 g，加水500 mL（50℃），不断搅拌，迅速加入胶体磨中，滴加挥发油乙醇溶液6 mL，研磨30 min，收集包合物，静置24 h，抽滤，45℃烘干，备用。

2.4.3 超声包合法 称取β-环糊精 24 g，加水500 mL（50℃），不断搅拌使其溶解，缓慢加入挥发油乙醇溶液6 mL，超声30 min，收集包合物，静置24 h，抽滤，45℃烘干，备用。

2.5 单因素试验

2.5.1 β-环糊精与挥发油比例 将水与β-环糊精的比例固定为20 ∶1，包合时间固定为30 min，分别研究β-环糊精与挥发油比例为4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1 时综合分数的变化。

2.5.2 水与β-环糊精比例 将β-环糊精与挥发油比例固定为8 ∶1，包合时间固定为30 min，分别研究水与β-环糊精比例为9 ∶1、11 ∶1、14 ∶1、17 ∶1、20 ∶1 时综合分数的变化。

2.5.3 包合时间 将β-环糊精与挥发油比例固定为8 ∶1，水与β-环糊精比例固定为20 ∶1，分别研究包合时间为10、20、30、40、50 min 时综合分数的变化。

2.6 响应面试验

利用DesignExpert.V8.0.6.1 软件以A（β-环糊精∶挥发油）、B（水∶β-环糊精）、C（包合时间）为影响因素，Y（综合分数）为评价指标，Box-Behnken 响应面法优化包合工艺。为了直观体现三因素对评价指标Y（综合分数）的影响，选择固定任意一个因素，分别考察因素A和因素B，因素A和因素C，因素B和因素C对Y的影响。

2.7 包合效果评价

包合物加适量无水乙醇，超声处理30 min，取上层挥发油备用。以未包合的原挥发油为对照，取挥发油10 mg，精密称定，加适量正己烷溶解，摇匀，即得。

色谱条件：HP-5MS 气相色谱柱（30 m，0.25 mm×0.25μm）；
载气为氦气；
流速为1 mL/min；
进样量为1μL；
初温为70℃，3 min 后以5℃/min 升至85℃，7.5 min 后以2℃/min 升至100℃，2.6 min 后以50℃/min升至230℃，保持5 min；
进样口温度为230℃。

3.1 天麻胶囊挥发油包合方式的选择

以“2.2”项下综合分数为评价指标，比较三种方法的包合效果，结果表明饱和水溶液法、胶体磨包合法、超声包合法的综合评分分别为53.12%、69.54%、60.18%，胶体磨包合法的综合分数高于饱和水溶液法和超声包合法，故采用胶体磨包合法进行后续试验。

3.2 单因素试验

3.2.1 β-环糊精与挥发油比例 在4 ∶1 ～ 12 ∶1的β-环糊精与挥发油梯度比例范围内，随着比例增加，综合分数呈现先升高后降低的趋势，在8 ∶1 时综合分数达到最大值，造成上述现象可能的原因是，随着β-环糊精的过量加入，未包合的β-环糊精流失，降低了收率，进而影响综合分数。故选择β-环糊精与挥发油的比例为6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1 三个水平进行响应面实验，见图1A。

图1 单因素试验结果Fig.1 Results of single-factor test

3.2.2 水与β-环糊精比例 在9 ∶1 ～ 20 ∶1的水与β-环糊精梯度比例范围内，当水∶β-环糊精 = 14 ∶1 时综合分数有最大值，造成上述现象可能的原因是，随着水的过量加入，溶解的β-环糊精逐渐增多，在过滤过程中流失，进而降低了综合分数。故选择水与β-环糊精比例为11 ∶1、14 ∶1、17 ∶1 三个水平进行响应面试验，见图1B。

3.2.3 包合时间 在10 ～ 50 min 的包合时间范围内，随着包合时间延长，综合评分呈现出先升高后降低的趋势，在25 min 时综合分数达到最大值，造成上述现象可能的原因是，随着包合时间的延长，部分包合液溅出，影响收率和包封率，降低综合分数。故选择包合时间为20、30、40 min 三个水平进行响应面试验，见图1C。

3.3 响应面试验

利用DesignExpert.V8.0.6.1 软件，Box-Behnken 响应面法优化包合工艺，响应面实验设计与结果见表1。对表1 中Y（综合分数）进行二次多元回归拟合，方差分析见表2。由表2 可知，建立的多元模型F=59.36，模型P＜0.000 1，达到极显著水平，表明拟合的模型差异具有统计学意义。失拟项P= 0.385 ＞0.05，表明其它因素对试验结果干扰较小，残差由随机误差引起。由F值可知，各因素对综合分数影响大小顺序为：C＞A＞B。对表1 数据进行拟合，得方程综合分数Y= 94.02 + 3.31A- 2.56B- 5.35C+ 1.63AB-0.47AC+ 7.91BC- 4.31A2- 7.31B2- 6.25C2，其中，A、B、C、BC、A2、B2、C2达到极显著水平（P＜0.01），模型拟合度较好。各因素对综合评分影响的响应曲面和等高线图见图2。

图2 各因素对包封率影响的响应面和等高线图Fig.2 Response surface and contour plot of the influence of each factor on encapsulation efficiency

表1 响应面试验设计与结果Tab.1 Response surface experimental design and results

表2 方差分析表Tab.2 Analysis of variance

经计算可得，当A为9.01 ∶1、B为12.84 ∶1、C为25.11 min 时，综合评分为96.91 分，考虑到生产成本和实际操作，将其修正为A为 9 ∶1、B为13 ∶1、C为25 min。在上述工艺下进行3 批验证试验，测得平均包封率为（79.07±3.62）%，收率为（75.48±5.27）%，综合评分为94.43±2.15，表明优化后的工艺重复性和稳定性较好。

3.4 包合效果评价

按“2.4.2”项下方法，选择最优包合工艺（β-环糊精与挥发油比例为9 ∶1、水与β-环糊精比例为13 ∶1，包合时间为25 min）进行包合。采用气相色谱法检测，结果见图3，包合前后图谱相似度为0.99，各成分基本无变化。

图3 挥发油（a）与包合物（b）GC 色谱图Fig.3 GC chromatograms of volatile oil (a) and inclusion (b)

天麻胶囊在《中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂》（第三册）中记载是治疗肢体拘挛、手足麻木的常用中成药，天麻胶囊制法中羌活、独活、当归提取挥发油，其余味药经煎煮、浓缩、制粒后喷入羌活、独活、当归挥发油，装入胶囊。由于挥发油具有易挥发、水溶性差等特点，上述制法所得的天麻胶囊无法保证其质量的稳定性，同时挥发油对胃肠道黏膜有一定的刺激性[15]，因此，需优化天麻胶囊的制法，提高制剂稳定性。β-环糊精包合法能将液体药物粉末化，是常用的保持挥发油质量稳定性的方法之一。本研究采用 Box-Behnken 响应面法优化得到天麻胶囊挥发油胶体磨包合工艺最佳工艺，该方法可为后续天麻胶囊制剂的开发奠定基础。研究发现胶体磨法较饱和水溶液法和超声法包合挥发油效果好，且胶体磨法包合率高、简便、快速。目前，高剪切分散乳化法因其能提供强大的剪切力，常被用来乳化、分散等操作，已被证明是包合挥发油的重要方法之一[16]。在包合物的制备过程中，经过静置、抽滤、干燥等工序，包合物有一定损失，同时存在生产周期长、成本高等问题，不便于大规模生产。喷雾干燥技术是解决上述问题的措施之一，喷雾干燥通过将包合液雾化成小液滴，再利用热空气进行干燥，能够在较短时间内迅速将包合液转化为固体粉末。在今后的研究中，也应重点考察喷雾干燥技术在制备药物挥发油包合物中的应用，为工业化生产奠定基础。

综合考虑生产成本和方便实际操作，得到天麻胶囊挥发油最佳胶体磨包合工艺条件为β-环糊精∶挥发油= 9 ∶1、水∶β-环糊精= 13 ∶1，包合时间为25 min。经验证天麻胶囊挥发油在包合前后成分基本无变化，工艺效果较好，稳定可行。在今后的研究中，应对比高剪切分散乳化法与胶体磨法包合的差异，为后续相关制剂的开发提供参考。

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