瑞替加滨抗惊厥及对惊厥性海马损伤保护效果的研究

徐静怡,张心雨,李连俊,刘阳,余建东,冯占辉,葛荣靖

惊厥(seizure)是由短暂脑功能障碍引发的一系列以躯体抽动为特征的疾病过程。严重或者持续时间较长的惊厥可致受累脑区发生惊厥后损伤,引起继发性脑功能障碍[1]。这种惊厥继发性脑损伤也可能是促进癫痫发生发展的原因。因此,及时中止发作等级较高或持续时间较长的惊厥具有非常重要的意义。

瑞替加滨(retigabine, RTG)是一种K+通道开放剂,特异性作用于电压门控K+通道 KCNQ2-5(Kv7.2-7.5)[2-3]。RTG可增加KCNQ2-5通道的开放频率及开放持续时间,通过增加K+外流对神经元发挥持续超极化影响,使过度兴奋的细胞恢复静息状态[4-5]。RTG也可减慢大脑中抑制性递质GABA的代谢[6],增强神经元中抑制性突触电流,发挥抑制神经元兴奋的作用[7-8]。在药代学方面,RTG易于吸收,Tmax为1～2 h。在单次和多次给药后,其血药浓度随剂量线性增加。本研究拟通过毛果芸香碱诱导的急性惊厥小鼠模型,采用RTG进行干预,分析其抗惊厥效果以及是否对海马神经元的惊厥性损伤具有保护作用,为探索该药的抗惊厥疗效提供实验数据。

1.1 实验设备及试剂

RTG(上海麦克林公司)、东莨菪碱(美国Sigma)、毛果芸香碱盐酸盐(美国MCE公司)、苯巴比妥钠(力捷进)、苏木素伊红(HE)染色试剂盒(碧云天)、Axon 700B放大器(美国Molecular Devices公司)、Axon 1550B数模转换器(美国Molecular Devices公司)、玻璃微电极(美国Sutter公司)、电极拉制仪(美国Sutter公司)及正置相差显微镜(日本尼康FN1)等。

1.2 实验动物及分组

成年雄性ICR小鼠40只,8周,体质量30～40 g,购于杭州子源实验动物科技有限公司,合格证号为SCXK(浙)2019-0004。本研究所有动物实验均符合《用于科学目的的动物保护欧共体条例(2010/63/EU)》,并获得蚌埠医学院动物研究伦理委员会的批准。实验动物饲养于专用的动物房,饲养环境恒定温度为23 ℃、保持光照/黑暗12 h恒定循环,自由饮水和摄食。40只ICR小鼠随机分为空白组(control group)、惊厥组(seizure group)、RTG组(RTG group)及苯巴比妥钠组(phenobarbital group),每组 10 只,适应性饲养1周后开始用于实验。

1.3 小鼠急性惊厥模型制作

腹腔注射东莨菪碱(2 mg/kg),30 min后再给予毛果芸香碱腹腔注射(285 mg/kg)诱发急性惊厥。若ICR小鼠1 h内出现Racine 4～5级惊厥发作(表1),在给予毛果芸香碱90 min后腹腔注射RTG(2 mg/kg,RTG组)[9-10],或腹腔注射苯巴比妥钠(94 mg/kg,苯巴比妥钠组)[11],继续观察1 h。详细给药方案见图1。对小鼠造模过程中各级发作的持续时间及发作次数进行统计。小鼠的惊厥发作等级按照Racine分级标准进行分级(表1)[12-13]。

表1 Racine的分级标准及特征

1.4 苏木素-伊红染色方法

急性癫痫模型建立1周后,用20%的乌拉坦麻醉小鼠,心脏灌流处死、取脑,将脑固定于4%的多聚甲醛24 h,组织在蔗糖中完成脱水后进行冰冻切片。贴片充分干燥后进行苏木素-伊红染色,显微镜明场拍摄海马区图片。

1.5 膜片钳记录方法

用异氟烷将小鼠诱导麻醉后,迅速断头取脑,与冰水混合并置于持续通入二元气(95% O2,5% CO2)的氧饱和人工脑脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF),对鼠脑行冠状切片(切片厚度为300 μm)。脑片置于持续通二元气的ACSF中,于35 ℃孵育30 min,再于室温孵育30 min。将孵育好的脑片转移至相差显微镜下观察并进行电生理记录(氧饱和ACSF持续灌流)。镜下选择海马齿状回颗粒细胞进行全细胞记录。ACSF成分(mM)为124 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、24 NaHCO3、5 HEPES、12.5 Glucose、2 MgSO4及2 CaCl2。电极内液成分(mM)为150 KGlu、0.5 EGTA、10 HEPES、4 NaCl、4 Mg2ATP、1 TrisGTP及5 phosphocreatine。电极电阻控制在5～8 MΩ,全细胞记录的串联阻抗控制在15～30 MΩ。

1.6 统计学方法

2.1 RTG可减少小鼠惊厥发作的等级及频次

在毛果芸香碱的作用下,小鼠出现不同级别的惊厥发作。本研究选择注射毛果芸香碱后1 h内有4～5级大发作的小鼠作为研究对象。采用苯巴比妥钠作为阳性对照药物。惊厥组只注射东莨菪碱和毛果芸香碱,RTG组与苯巴比妥钠组在此注射基础上,观察到大发作后,于毛果芸香碱注射后90 min进行干预药物注射(图1)。观察90～150 min时间段内各组小鼠的惊厥发作等级,比较药物的干预效果。

惊厥组小鼠在经历90 min的前期发作后,在90～150 min观察时间窗内仍具有较高频率的惊厥发作,主要以1～3级发作为主,也可出现4～5级大发作。惊厥组小鼠在造模期内死亡率为40%。与惊厥组比较,RTG组小鼠注射RTG后无4～5级大发作出现,但仍可出现数次3级发作,且惊厥发作等级及持续时间降低。注射阳性对照药物苯巴比妥钠后,苯巴比妥钠组小鼠不再出现惊厥发作症状。RTG组与苯巴比妥钠组小鼠的死亡率均在10%以下。

注:实验分为4组,小鼠惊厥发作等级用不同颜色表示,并以时间轴进行呈现。红色箭头为RTG和苯巴比妥钠的注射时间。开始节点与结束节点之间为组间惊厥发作对比的时间窗口。药物干预后,与惊厥组比较,RTG组小鼠的发作等级降低且频次逐渐减少。

2.2 RTG可减轻癫痫小鼠海马神经元的损伤

在急性惊厥造模结束后,继续饲养小鼠1周,以观察惊厥后的迟发性脑损伤情况。选取海马作为观察脑区,发现模型小鼠在海马CA1区出现较为显著的惊厥后神经元损伤。

苏木素-伊红染色结果显示,空白组小鼠CA1区细胞带排列整齐、紧密,细胞核清晰、胞质饱满;惊厥组小鼠海马区则出现明显的结构破坏,神经元细胞周围间隙增大、排列紊乱。细胞丢失导致细胞带变窄,细胞密度降低(图2A)。与惊厥组比较,RTG组小鼠CA1区细胞损伤程度较轻。与空白组比较,RTG组小鼠的细胞密度降低(P<0.01),细胞带宽度变窄(P<0.05)。苯巴比妥钠组小鼠CA1区细胞带形态与RTG组相似,两组在细胞带宽度及细胞密度两个方面比较差异均无统计学意义(图2B、C)。提示RTG具有与苯巴比妥钠相似的惊厥损伤保护效果。

注:A为苏木素-伊红染色图(海马CA1区);B为海马CA1区细胞带宽度;C为海马CA1区细胞带内细胞密度。B、C图中每个点表示一只小鼠。组间方差齐,采用单因素方差分析。*为P<0.05,**为P<0.01。

2.3 RTG可降低惊厥小鼠海马齿状回颗粒细胞的兴奋性

齿状回是海马外信息流入海马的重要门控。惊厥后,海马齿状回颗粒细胞的兴奋性增高,是促进海马环路过度兴奋的重要因素。本研究采用膜片钳记录空白组与惊厥组小鼠海马齿状回颗粒细胞的兴奋性。在惊厥组小鼠完成正常记录后随即灌流RTG,观察其对小鼠颗粒细胞放电的影响。空白小鼠颗粒细胞的放电频率较低,而惊厥组小鼠颗粒细胞的兴奋性显著增高(图3)。RTG可显著减少惊厥小鼠颗粒细胞的放电,降低其兴奋性,提示惊厥中应用RTG可通过降低颗粒细胞的兴奋性,来减少兴奋性信息向海马中的传入。

本研究应用毛果芸香碱诱导急性惊厥小鼠模型,采用RTG进行抗惊厥处理并与当前一线抗惊厥药物苯巴比妥钠的干预效果进行比较,分析RTG的抗惊厥效果及对海马神经元损伤的保护作用。本研究结果表明,RTG有一定的抗惊厥作用,可减少惊厥的发作等级及频次,并对惊厥性海马损伤具有显著的保护作用。

RTG是KCNQ2/3通道的特异性开放剂,可以增加由该类通道介导的外向K+电流[14-15]。这种K+电流受到M型胆碱能受体的调控,又被称为M电流[16-17]。由于该通道慢激活慢失活的动力学特点,M电流变化速度较慢,往往影响序列动作电位后半段动作电位的发放,使得神经元的发放呈现为发放频率逐渐降低的适应性发放模式[18-20]。此外,RTG可增加GABAA受体介导的抑制性突触后电流(Inhibitory postsynatic current, ISPC),增强GABA能递质的抑制效果[8]。

注:A为空白组(黑色曲线)与惊厥组(红色与灰色曲线)小鼠海马齿状回颗粒细胞动作电位。惊厥组颗粒细胞放电增多(红色曲线),灌流RTG可降低惊厥小鼠颗粒细胞的兴奋性(灰色曲线);B为颗粒细胞输入输出曲线。惊厥组小鼠(红色)颗粒细胞放电比空白组(黑色)增多。RTG可降低惊厥小鼠颗粒细胞的输入输出曲线,减少颗粒细胞放电(灰色);C为取B图曲线中100 pA刺激电流强度所诱发的颗粒细胞动作电位个数,对比灌流RTG前后对颗粒细胞放电的抑制作用(红色和灰色分别表示惊厥组小鼠同一颗粒细胞灌流RTG前后的放电情况)。空白组虚线表示该组平均值位置。B、C图中每个点表示一个颗粒细胞。组间方差齐,空白组与惊厥组之间采用t检验,惊厥组与RTG组之间采用配对t检验。**为P<0.01。

基于以上机制,RTG通过抑制神经元放电从而发挥抗癫痫作用。从本研究的实验结果来看,RTG虽然可以减少小鼠惊厥发作的等级及频次,但不能完全消除发作。经过RTG处理的小鼠,仍然可出现3级以下发作。而苯巴比妥钠的抗惊厥效果显著,可以完全中断小鼠的惊厥发作,从而使小鼠进入镇静麻醉状态。然而,在海马损伤方面,RTG的保护效果与苯巴比妥钠相似,均可显著减少海马神经元的损伤。提示对于脑组织损伤而言,更重要的是及时中止高等级的发作。此外,苯巴比妥钠可快速解除肢体阵挛,是临床治疗癫痫大发作的首选药物,但由于其血药浓度的不稳定性及肝损伤等副作用,故仍有待寻找既可有效抗癫痫发作而副作用又小的药物来进行替代[11]。

颗粒细胞是海马外电信号流入海马的门控因素[21]。在惊厥小鼠模型中,颗粒细胞的兴奋性增加,促进海马外信息传入海马回路,引起海马三突触环路的过度激活,该过程是促进癫痫发生发展的重要机制[22]。本研究中全细胞电流钳记录显示,急性惊厥小鼠海马齿状回颗粒细胞在RTG作用后电发放数量明显减少。因此,应用RTG可以降低惊厥小鼠海马齿状回颗粒细胞的兴奋性,有利于海马内电活动的稳定。

综上所述,RTG在急性惊厥模型小鼠中具有抗惊厥作用,对惊厥性海马损伤具有较好的保护效果。其机制可能涉及对颗粒细胞兴奋性的抑制,减少海马内的兴奋性损伤。

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