基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术结合分子网络快速筛查3种蓟属药用植物化学成分

王宇航，黄晓欣，叶定红，刘勇*（. 北京中医药大学中药学院，北京 02488；
2. 北京中医药大学北京中医药研究院，北京 02488；
. 宁波甬蓟农业发展有限公司，浙江 宁波 558）

大蓟Cirsium japonicumFisch.ex DC和小蓟Cirsium setosum（Willd）MB.大多以全草、地上部分或根入药，近年来，大量药理学实验证明该属植物具有保肝、止血、抗炎、抗疲劳等多种药理作用[1-10]。杭蓟Cirsium tianmushanicumShih与两者同为菊科蓟属植物，是宁海力洋、胡陈一带的地方用药，具有显著的止血、去黄疸、降血压的功效[8]。

大蓟、小蓟在《中国药典》中的功效主治描述完全一致，未能起到指导临床应用的作用[11-12]。且两者化学成分研究大部分都集中于单一成分的分离和鉴定，无法系统地从成分层面研究大小蓟差别；
而杭蓟因野生资源有限，暂未发现大规模群居，其成分和药效的研究还处于停滞阶段，仅凭民间用药理论无法为杭蓟作为药用植物提供科学依据。

在药用植物中，许多代谢物具有相同的分子亚结构，并形成不同化学类型的结构相关分子家族，从而增加了对药用植物中复杂成分体系定性分析的难度。全球天然产物分子网络集群数据库GNPS（Global Ntatural Product Social Molecular Networking，https：//gnps.ucsd.edu/）是在现有的多个质谱数据库基础上，进行新的谱图注释，最终建立的包括 272 个公共数据集和8400万个二级图谱的公共数据分析平台[13]；
利用GNPS创建基于各成分质谱二级碎片相似性的分子网络，同时与液质联用数据相结合，可以更直观地观测到测试样品中所有能够检测到的化合物准分子离子，反映串联质谱试验中捕获的分子多样性[14]；
同时液质联用技术因其高通量和高灵敏度多被用于药用植物成分的快速筛查研究，更有助于复杂成分体系的定性分析[15-16]。本研究拟采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱质谱结合分子网络技术对大蓟、小蓟、杭蓟化学成分进行快速筛查鉴定，为后续蓟属药用植物的质量控制和药效评价等提供科学依据。

1.1 仪器

Q-Exactive-Orbitrap-MS四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（美国Thermo Scientific 公司），配有热喷雾离子源（HESI）、Xcalibur4.1化学工作站（美国Thermo公司）；
Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused 超高液相色谱系统（含Chromeleon 7 工作站，Evolution220型紫外-可见分光光度计，赛默飞世尔科技公司）；
Millipore Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore公司）；
Sartorious BT 25S型万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 试药

芦丁（货号B20771-20 mg）、新绿原酸（货号B25371-20 mg）、Pectolinarin（货号B20249-20 mg）、绿原酸（货号B20782-20 mg）、Buddloside（货号B20860-20 mg）、槲皮素（货号B20527-20 mg）、山柰酚（货号B21126-20 mg）（HPLC测纯度均≥98%，上海源叶生物科技有限公司），大蓟、小蓟（北京同仁堂药业公司），杭蓟采自浙江宁波，经北京中医药大学刘勇教授鉴定为菊科蓟属大蓟Cirsium japonicumFisch.ex DC，小蓟Cirsium setosum（Willd）MB和杭蓟Cirsium tianmushanicumShih的干燥地上部分。甲醇、乙腈（色谱纯，Fishier Scientific公司），质谱纯甲酸、氯仿（天津市科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2.1 样品制备

供试品制备：取样品约1 g研磨（过4号筛），精密称定，置索氏提取器中，加石油醚适量（50 mL），加热回流2 h，弃去石油醚液；
待药渣挥干后加入70%甲醇20 mL，索氏提取2 h，滤过，滤渣用70%甲醇5 mL洗涤，合并洗液与滤液，浓缩溶液至10 mL，转移至10 mL量瓶中，用微孔滤膜（0.45 μm），滤过，即得。

对照品制备：称取山柰酚、绿原酸、芦丁、Pectolinarin、Buddloside、槲皮素对照品适量分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得单一对照品溶液，试验前混合各溶液得混合对照品溶液，稀释至各对照品质量浓度为1 mg·L－1。过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.2 色谱条件

色谱柱 Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相：A为乙腈溶液，B为甲酸水溶液；
梯度洗脱（0.0～3.0 min，5%A；
3.0～35.0 min，5%～75%A；
35.0～40.1 min 75%～5%A；
40.1～45 min，5%A）；
流速0.3 mL·min－1，柱温 35℃，进样量3 μL。

2.3 质谱条件

HESI离子源，负离子检出模式，扫描范围m/z50～1500；
离子源温度350℃，电离源电压4 kV，毛细管电压35 V，管透镜电压110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度＞99.99%），鞘气流速40 arb，辅助气流速20 bar；
数据采用傅里叶变换高分辨全扫描方式（TF，full scan，Resolution 30 000）数据依赖性（data-dependent acquisistion）ddMS2；
碰撞模式：运用CID和HCD相结合的碎解方式；
碰撞能量：Stepped NCE 50%；
母离子列表（parent ion list）PIL-MS2。

3.1 杭蓟成分鉴别

按照“2.3”项下方法分析3种蓟属药用植物提取物，得到其负离子模式下的总离子流图（见图1）。结合对照品（见图2）和参考文献对其进行成分确认，在Parallel Reaction Monitoring（PRM）模式下快速筛查到3种植物中的71种化合物。其中包括22种有机酸类、24种黄酮类、3种醌类、5种三萜类、3种挥发油类及14种其他类化合物，详情见表1。

表1 3种植物地上部分化学成分负离子模式下质谱信息Tab 1 Mass spectrometric information in the above ground part of three plants under negative ion mode

图1 样品负离子模式下的总离子流图Fig 1 Total ion flow diagram of sample in negative ion mode

图2 混合对照品总离子流图（A）及杭蓟中各对照品提取离子流图（B）Fig 2 Total ion flow diagram of reference substance（A）and ion flow chart of reference substances extracted from Cirsium tianmushanicum Shih（B）

3.2 对照品的质谱裂解行为

奎宁酸类衍生物：结合参考文献[17-20]和二级图谱数据发现，在HCD和CID碰撞裂解下，绿原酸和新绿原酸均会产生m/z191.1571 [M-caffeoyl-H]—和m/z179.3615 [caffeic acid-H]—两个特征碎片离子，其中m/z191.1571进一步碎裂形成m/z173.2372 [M-caffeoyl-H2O-H]—。两者的主要裂解区别是由于酰化位置不同，绿原酸产生的碎片离子m/z135.4260的丰度大于新绿原酸。综上，奎宁酸类化合物的质谱碎裂规律主要是围绕酯键断裂形成奎宁酸母核碎片和各类酚酸如咖啡酸、阿魏酸的碎片为主，此类衍生物主要结构单元如图3所示。

图3 奎宁酸类衍生物的结构单元Fig 3 Structure units of quinic acid derivatives

黄酮类化合物：根据参考文报道[21-23]和高分辨质谱数据，对黄酮化合物质谱裂解规律进行归纳总结：黄酮类化合物裂解方式主要为糖苷键的解离和黄酮母核C环的断裂；
对于糖苷键的解离，常存在中性丢失糖残基而得到苷元离子；
对于黄酮母核上C环的1/3、1/4、0/2、0/3、0/4 键断裂会产生i，jA－和i，jB－两类碎片离子[24]。还可以观察到常见的中性丢失，如 CO（28 Da）、CO2（44 Da）、H2O（18 Da）等中性丢失；
分子中带有甲氧基（·OCH3）等基团时还可以发生自由基（·CH3，15 Da）丢失。

3.3 奎宁酸衍生物快速筛查

3.3.1 单咖啡酰奎宁酸 化合物10、18、22的准分子离子峰m/z353.0881、353.0893、353.0890，推测其元素组成为C16H18O9（0.28、0.85、0.57），主要碎片离子m/z191.1571 [M-H-caffeoyl]－、179.3615 [caffeic acid-H]－和173.2372 [M-H-caffeoyl-H2O]－符合咖啡酰奎宁酸（caffeoylquinic acide，CQA）的裂解规律，通过对照品比对（见图4），推断化合物10、18分别为绿原酸、新绿原酸；
结合参考文献[25-27]，当酰化位置在3-位时m/z179.3615丰度比在5-位上高[28]，根据极性大小和上述规律初步判断化合物22为隐绿原酸。CQA类化合物具有能清除自由基、抗菌消炎的活性，170 余种具有清热解毒、抗菌消炎的中成药均含有CQA且为主要成分[29]。

图4 奎宁酸类衍生物对照品质谱图以及裂解规律Fig 4 Standard mass spectra and pyrolysis rules of quinine compounds

3.3.2 双咖啡酰奎宁酸（DiCQA） 化合物42、46、51准分子离子峰[M-H]－为m/z515.1224、515.1226、515.1219，推测其元素组成为C25H24O12（0.78、0.58、0.97），主要碎片离子m/z353.2473 的MS3碎片离子与绿原酸的MS2碎片离子基本一致，初步判断此类化合物为DiCQA，母核结构如表2所示。根据报道，4-位取代时二级碎片离子基峰为m/z173、而3-位取代的离子碎片m/z179.3613丰度为m/z191.1573的一半、5-位取代时，m/z179.3617相对丰度较1-和3-位取代要高，结合表1中的碎片离子初步推断化合物42、46、51分别为3、5-O-二咖啡酰奎宁酸、4、5-O-二咖啡酰奎宁酸和3、4-O-二咖啡酰奎宁酸[28]。以3、4-O-二咖啡酰奎宁酸为例具体的碎片离子信息和裂解规律如图5A所示。

图5 推断化合物的质谱图和可能的裂解途径Fig 5 Spectrum and possible fragmentation pathway of chemical substances

3.3.3 肉桂酰奎宁酸（pCoQA） 化合物14、27、31精确准分子离子峰[M-H]－为m/z337.0931、337.0932、337.7819，分子式C16H18O8，结合文献和母离子分子离子质量[29]推断化合物可能为pCoQA类化合物。3-pCoQA、5-pCoQA、4-pCoQA二级碎片离子基峰分别是m/z163.3838、173.7508、191.1561，结合保留时间和参考文献[30-31]判断化合物14、27、31分别为3-香豆酰基奎宁酸、5-香豆酰基奎宁酸、4-香豆酰基奎宁酸。以3-香豆酰基奎宁酸为例，其具体的碎片离子信息和裂解规律见图5B。

3.3.4 阿魏酰奎宁酸（FQA） 化合物 20、28、30准分子离子峰分别为m/z367.1039、367.1037、367.1021，二级质谱裂解过程中产生m/z191.3647、191.5971、191.5971 [M-H-feruloyl]－和m/z173.7420、173.5543、173.5543 [M-H-feruloyl-H2O]－等二级碎片离子，根据参考文献和母离子分子离子质量推断为FQA[32]；
而根据基峰的不同可判断FQA的同分异构体3-FQA、4-FQA、5-FQA的二级碎片基峰分别为m/z193.8710、173.5543和191.5971，初步推测化合物20、28、30分别为3-O-阿魏酰奎宁酸、4-O-阿魏酰奎宁酸、5-O-阿魏酰奎宁酸。

从3种菊科蓟属植物中分离出多种以奎宁酸为母核具有药效活性的化合物，此类成分普遍具有抗菌、抗病毒、保肝和心血管保护等作用[33]，推测其药效物质基础为奎宁酸衍生物成分群，可能与抗炎保肝作用相关。

3.4 黄酮类化合物快速筛查

化合物33、35、55部分二级离子与槲皮素碎片离子相同，初步推断为槲皮素和苷元分别为槲皮素的黄酮苷，3个化合物的准分子离子峰为m/z609.1458、463.0877、301.0353，结合对照品质谱图（见图6）和参考文献[34]分析判断化合物33、35、55分别为芦丁、金丝桃苷和槲皮素，其中金丝桃苷裂解途径如图5C所示。

图6 黄酮类对照品质谱图以及裂解途径Fig 6 Standard mass spectrum of flavonoids and fragmentation pathway

化合物34、36、37、39、40、60准分子离子峰分别为m/z593.1523、461.0733、577.2875、593.1523、447.0948、285.0408，上述化合物的MS2均产生m/z285、257等山柰酚对照品碎片离子相同二级离子，且主要碎片离子强度与山柰酚对照品二级图谱相同，判断化合物36、38、40、42、43的苷元为山柰酚或者以山柰酚为苷元的黄酮苷，结合参考文献[35]和对照品初步判断化合物分别为山柰酚-7-O-新橘皮糖苷、山柰酚葡萄糖醛酸苷、山柰苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、山柰酚。以山柰酚葡萄糖醛酸苷为例，其具体的碎片离子信息和裂解规律。

同理，根据该类化合物在质谱条件下有相似的裂解规律在蓟属植物中共筛查到黄酮类化合物24种，详情见表1。

3.5 3种蓟属植物分子网络分析

在快速筛查蓟属植物化学成分的基础上，运用分子网络技术进一步进行复杂成分的类别分析[36-38]。本研究中分别使用绿原酸、山柰酚、芦丁、槲皮素等对照品作为“种子”节点进行分类筛选，然后根据“种子”成分的二级碎片图谱进而计算各成分与“种子”成分的相似度，根据相似度的值进行聚类分析，并可以在分析的过程中计算同一化合物在不同植物中的相对含量[39]。如图7所示，每个节点代表 1 种化合物，运用丰度归一化算法可以通过显示不同颜色所占面积的大小表示该化合物在不同样品中的相对含量[40]。结果将网络图划为A、B、C、D 4个主要簇，A区域中检测到的所有化合物都含有m/z191奎宁酸碎片离子，对照品山柰酚、新绿原酸出现在该区域；
B区域主要为蒽醌母核碎片离子m/z208、180[41]；
C区域所有化合物都含有m/z300碎片离子，对照品芦丁、槲皮素出现在该区域；
D区域所有化合物都含有m/z285的山柰酚碎片离子，对照品山柰酚出现在该区域。同时也在各区域内发现准准分子离子峰m/z505.2981、415.0897、823.4723等一系列未知化合物，由于暂无相关文献报道，难以确定相关构型，有待后续通过制备分离和核磁鉴定等方法进行研究。

图7 3种蓟属中主要成分网络图Fig 7 Molecular network of main compounds from 3 Cirsium mill medicinal plant

3.6 基于分子网络分析主要化合物在3种蓟属中的分布情况

奎宁酸类在3种蓟属植物的分布较广，新绿原酸、绿原酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸甲酯、3-O-阿魏酰奎宁酸等都分布在大蓟、小蓟、杭蓟3种蓟属中，在大蓟、杭蓟中奎宁酸类化合物相对含量较高；
蒽醌类化合物分布差异较明显、主要分布在小蓟中，主要成分芦荟大黄素在小蓟中含量也相对较高；
C、D区域中黄酮类化合物在大蓟、小蓟中分布较广，特别是以山柰酚为苷元的黄酮苷类化合物在小蓟中具有较高的相对含量。上述相比于大蓟、小蓟在相对含量上具有一定程度差异的成分可能是未来研究杭蓟药理作用并区别于大蓟、小蓟药效的重要有效成分。

在已筛查化合物中，共有36个化合物是3种蓟属植物的共有成分；
43个化合物为大蓟和小蓟的共有成分；
杭蓟与大蓟、小蓟的共有成分分别为39个、38个化合物，结合图7所示，对3种蓟属植物中成分分布研究得出，大蓟、小蓟、杭蓟3种蓟属相似度较高，前两者可在临床用药中替代入药，而杭蓟作为宁海力洋、胡陈一带传统民间滋补药材在成分层面上证明了具有一定的药用价值，为今后进一步阐明杭蓟药效提供了科学依据。

本研究利用UHPLC-Q-Exactive-Plus-Orbitrap-MS结合分子网络技术首次对大蓟、小蓟、杭蓟中的化学成分进行快速定性鉴别，通过对照品、文献数据对照和质谱裂解规律共快速筛查出3种植物71种化合物，包括22种有机酸类、24种黄酮类、3种醌类、5种三萜类、3种挥发油类及14种其他类化合物，并使用分子网络技术对有效成分进行相对含量的评价，对质谱复杂体系的成分量化有一定的参考价值[42]。但不足之处在于ESI作为一种软电离方式，不同单体成分的离子化效率不同，量化的结果存在一定的误差，后续还需要通过对照品进行绝对含量的比较。

大蓟、小蓟作为传统药用植物，为同科不同属植物，本研究提供了两者主要有效成分的异同，为大蓟、小蓟后续的药效研究从化学成分水平上提供思路。而研究结果同时表明杭蓟在有效成分层面上与成熟的药用植物大蓟、小蓟高度相似，具有较高的临床研究价值和药用潜力，有利于杭蓟作为药用植物更好地推广，并为在当地产生经济效益和科技成果转化作出贡献。本研究进一步加深了对蓟属植物的认识，为后续蓟属药用植物的质量控制和药理作用研究提供了科学依据。

猜你喜欢小蓟奎宁分子离子基于HPLC-HESI-HRMS 的水冬瓜根皮化学成分分析食品工业科技(2021年17期)2021-09-14PF+分子离子激发态的理论研究高师理科学刊(2020年11期)2021-01-04基于LC-MS/MS的咖啡酰奎宁酸异构体鉴别方法研究分析测试学报(2020年4期)2020-05-0992种工业染料在四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱中的离子化规律理化检验-化学分册(2020年3期)2020-04-24不同提取方式下小蓟、小蓟炭提取物抗炎、凝血活性的比较浙江海洋大学学报(自然科学版)(2019年3期)2019-08-12计算氢分子离子键能的一种新方法山东化工(2018年16期)2018-09-12光学纯(R)-3-奎宁醇制备技术研究进展发酵科技通讯(2018年2期)2018-07-06神奇的小蓟基层中医药(2018年3期)2018-05-31十亩间文苑·经典美文(2016年9期)2016-12-21二咖啡酰奎宁酸与人血浆阿司匹林酯酶的分子对接中成药(2014年9期)2014-02-28