危害茶树菇新害虫——Bradysia,peraffinis,Tuomikoski,1960(Diptera:,Sciaridae)的生物学特性

王赟萍,贺佩珊,马吉平,钟国祥,王素贞,肖银润,熊小文,张 诚,*

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所,江西 南昌 330200; 2.江西农业工程职业学院,江西 宜春 331200)

茶树菇(Agrocybeaegerita),属伞菌目(Agaricales)粪锈伞科(Bolbitiacea)[1],它不仅味道鲜美、营养丰富,而且还是民间药用菌,具有重要的经济价值和药用价值[2]。由于茶树菇在栽培过程中,菌丝吃料后会产生酒酚香味物质[3],生长的子实体也会散发特殊的香味,因而十分受昆虫的青睐,吸引菇蚊、菇蝇取食产卵,引起茶树菇虫害的发生[4]。

菇蚊、菇蝇是对危害食用菌双翅目害虫的统称,其中眼蕈蚊科迟眼蕈蚊属(Bradysia)和厉眼蕈蚊属(Lycoriella)的一些种类对食用菌危害较重[5],在我国多个省份广泛分布,我国已经记录的菇蚊、菇蝇有100多种[6]。幼虫取食菌丝,严重时菌袋菌丝被逐渐啃完,出现“退菌”现象;幼虫啃咬、吞噬原基或幼小的菇蕾,造成严重减产,甚至绝收[7]。眼蕈蚊发育历期短[8],可以在短时间内建立种群,对食用菌产业带来巨大的经济损失。我国眼蕈蚊相关研究工作起步较晚[6],研究不够系统,因而有必要对眼蕈蚊开展深入的研究,鉴定其种类,明确其生活史、发生规律、危害特点等,为探索具有针对性、安全性、高效性的综合防治措施奠定基础。

本课题组在江西省农业科学院茶树菇种植基地发现了一种危害茶树菇的蕈蚊,通过DNA条形码技术——利用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome oxidase subunit Ⅰ, mtDNA-COⅠ)基因序列对其进行鉴定[9],明确其种类,并对该蕈蚊进行制片、拍照,描述其主要形态特征,另外,通过恒温箱室内饲养,观察和记录其生物学,旨在为该虫的综合治理研究奠定基础。

1.1 标本的采集与分子鉴定

在茶树菇出菇期,成虫标本由作者等采自江西省农业科学院茶树菇种植基地,并将新鲜标本浸泡于无水乙醇(≥99.7%)中带回实验室,放置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 DNA提取

使用动物DNA提取试剂盒(TSINGKE,通用型)对该昆虫进行DNA提取,提取步骤参照该试剂盒的方法,将提取获得的DNA置于-20 ℃条件下保存备用。

以上述DNA为模板,使用引物LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)对COⅠ基因进行扩增。PCR体系为:擎科金牌 Mix(green) 22 μL,DNA 1 μL,上下游引物各1 μL。PCR程序为: 98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s;55 ℃ 10 s;72 ℃ 20 s,共计35个循环;72 ℃ 5 min,4 ℃条件下保存。将PCR产物置于-20 ℃条件下保存。

获得的PCR产物送擎科生物技术有限公司进行双向测序。

1.3 系统发育树构建和遗传距离分析

将公司返回的序列用DNAstar进行拼接并去除序列两端的引物。测序结果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上用BLAST工具进行同源性比对,并结合GenBank中同源序列,使用MEGA 7.0软件,采用邻接法(neighbor-joining method, NJ),以Epidapussp. JQ613871为外群,基于Kimura-2参数模型,构建基于迟眼蕈蚊COⅠ基因序列系统发育树,进行分子鉴定和遗传距离分析。系统发育树各进化枝进行Bootstrap 1 000次置信度检验。同时将实验获得的序列上传至NCBI数据库获得对应的序列号。

1.4 形态特征观察与描述

将成虫触角、下颚须、前足胫节、尾器、前翅制成玻片标本,标本制作参照Steffan[10]和张晓云等[11]的方法。用尼康显微镜(Nikon, SMZ25),观察成虫和标本的形态特征,并拍照、描述。

1.5 饲养与生活史观察

2020年8月至2021年8月在江西省农业科学院茶树菇种植基地对蕈蚊的生活习性、危害特点进行观察记录。按照张宏瑞等[12]的方法,将新产的卵放入长满茶树菇3号菌丝的培养皿中,在人工气候箱内饲养,饲养条件温度(25±1) ℃,相对湿度(75±5)%,光周期L∶D=12 h∶12 h。羽化后的成虫转入新的培养皿中。观察并记录该幼虫的孵化、取食、化蛹、羽化、交配、产卵等行为。

2.1 CO Ⅰ基因扩增与测序

对该虫提取的基因组DNA进行PCR扩增,经凝胶电泳结果显示,在约750 bp处有1条特异性扩增条带(图1)。

1,眼蕈蚊样品;2,阴性对照;M,DL5000 DNA marker。1, Sample of Sciaridae; 2, Negative control; M, DL5000 DNA marker.图1 CO Ⅰ基因扩增结果Fig.1 PCR amplification of the CO Ⅰ gene

2.2 分子鉴定与遗传距离分析

将扩增引物剪切后,COⅠ基因片段长658 bp。将测序结果在GenBank中对序列进行Blast同源性比对分析,结果显示该虫与Bradysiaperaffinis的COⅠ序列(登录号:JQ613799)有99.85%相似性,其种内遗传距离为0.002,与其他Bradysia属的种间遗传距离在0.162～0.198。序列上传至NCBI数据库,登录号为MZ956154。基于16个迟眼蕈蚊COⅠ的遗传距离见表1。

表1 十六个迟眼蕈蚊CO Ⅰ基因序列的种内与种间的遗传距离Table 1 Intra-and inter-specific genetic distances of 16 Bradysia species based on the sequence of mitochondrial CO Ⅰ genes

将测定的序列与迟眼蕈蚊属16条COⅠ基因序列进行比对后构建系统进化树(图2),以Epidapussp. JQ613871为外群。其聚类分析结果表明,迟眼蕈蚊属不同种的迟眼蕈蚊位于不同的分支,不同种的迟眼蕈蚊区分明显。江西省采集的标本B.peraffinisMZ956154,与B.peraffinisJX418077和B.peraffinisJQ613799聚为一支。

☆,江西采集的样本。☆, The specimen collected in Jiangxi province.图2 运用邻接法构建16个迟眼蕈蚊昆虫CO Ⅰ基因序列的系统发育树Fig.2 NJ trees based on the analysis of 16 Bradysia species CO Ⅰ gene sequences

2.3 分类地位及形态特征

分类地位:B.peraffinis属于双翅目(Diptera)眼蕈蚊科(Sciaridae)迟眼蕈蚊属(Bradysia)。

形态特征如下。

卵:成虫常产卵于培养料缝隙中,一般为聚产(图3-A、B),也有散产,散产有1粒、2粒、3粒、4粒等,聚产少的有20～30粒,多的有60～120粒。卵为椭圆形,卵长约0.20 mm(表2),表面光滑有光泽。初产时淡黄色(图3-A、B),约2～3 d后卵一端逐渐变成深黄色,在孵化前变成黑色。

幼虫:体细显头无足形,老熟收缩状态下平均体长约5.43 mm(表2),头部黑色坚硬,全身透明,咀嚼式口器,无腹足和刚毛,有吐丝拉网的习性(图3-C、D)。

蛹:长2.29 mm(表2),化蛹前幼虫身体变短变粗(图4-A),刚化蛹颜色较浅,淡黄色(图4-B、C)逐渐变成深黄色,复眼逐渐变黑,羽化前蛹体暗褐色(图4-D)。被蛹,复眼、翅牙、足清晰可见,腹部向腹面弯曲。

A,化蛹前;B,蛹,腹面观,C,蛹,侧面观;D,羽化前。A, Before pupation; B, Pupa, ventral view; C, Pupa, lateral view; D, Before eclosion.图4 Bradysia peraffinis的蛹Fig.4 Pupas of the Bradysia peraffinis

雄成虫(图5-C、D):平均体长2.08 mm(表2),体黑褐色;触角、头部、胸部、腹背及尾器深于其他部位;前翅淡色,翅脉明显;足细长,浅黑褐色,基节、腿节较胫节、跗节浅;触角第4 鞭节长约为宽的1.19倍(图6-A);下颚须3节(图6-B),基节具毛,中节卵圆形,端节长约为中节的1.16倍;前足胫节有一横排胫梳(图6-C);尾器方形(图6-D),着生细长刚毛,生殖刺突长约为宽的2.69倍,端部密生刚毛,末端着生大刺;前翅翅脉C和R具毛,M和Cu无毛,R1≈0.54 R,C≈0.61 W(图6-E)。

A,雌虫,背面观;B,雌虫,侧面观; C,雄虫,背面观;D,雄虫,侧面观;E,交配。A, Female, dorsal view; B, Female, lateral view; C, Male, dorsal view; D, Male, lateral view; E, Mating.图5 Bradysia peraffinis的成虫Fig.5 Adults of the Bradysia peraffinis

A,第4鞭节;B,下颚须;C,前足胫节;D,雄性尾器腹面观;E,雌性翅脉。A, The 4th flagellomere; B, Palpus; C, Fore tibiae; D, Hypopygium, male, ventral view; E, Wing vein, female.图6 Bradysia peraffinis的主要形态特征Fig.6 Morphological characteristics of the Bradysia peraffinis

雌成虫(图5-A、B):平均体长2.54 mm(表2),特征与雄成虫相似。

表2 Bradysia peraffinis各虫态体长Table 2 Body length of Bradysia peraffinis

2.4 中国分布

湖北省[13]、江西省(新纪录)。

2.5 寄主

可危害香菇[13]和茶树菇。

2.6 生活习性和危害特征

2.6.1 生活史观察

对卵、幼虫、蛹、成虫历期观察表明,在培养箱内温度(25±1) ℃,相对湿度(75±5)%,眼蕈蚊完成一代需20～29 d,各虫态发育历期见表3。

表3 四种虫态历期Table 3 The development time of 4 stages

2.6.2 成虫交配及产卵习性

观察发现,成虫活泼善飞,具有趋光性,喜欢在菇房电灯周围、玻璃窗上行动,常在培养料、菌袋口、子实体上爬行、交尾,交尾时雄虫表现主动,腹部末端向腹内弯,成钩状,紧追雌虫,快速挨靠雌虫尾端,张开抱器钳住雌虫腹部末端进行交尾(图5-C)。交尾1～2 d后雌虫产卵,产卵后1～2 d内死亡。

茶树菇菌包开袋出菇时,成虫从袋口处进入菌包,将卵产至湿润、隐蔽处,如培养料间隙、菌柄丛的间隙、菌褶间等。

2.6.3 危害特点

B.peraffinis的发生密度受季节影响较大,3—6月份为高峰期,主要以幼虫危害菌丝,一年发生多代,世代重叠,全年均可发生。产卵后3～5 d孵化,幼虫生活在腐殖质丰富的潮湿环境中,但水分过多时,幼虫和卵均容易溺水死亡。幼虫多钻入长满菌丝的栽培袋内,啃食菌丝、子实体以及培养料,被取食过的地方呈珊瑚状,取食后留下粉尘状黄褐色粪粒,菌袋内形成明显的“虫道”,危害严重时,原基消失,子实体发烂,菌柄蛀成海绵状,菌盖只剩一层表皮,菌丝衰退,不能出菇,基质松散,有大量红褐色粉末,甚至导致整个菌包报废(图7-A、图7-B)。幼虫从孵化后到化蛹前一直在菌袋内发育,老熟幼虫爬至培养料口化蛹,羽化后飞出菌袋。

A,袋内危害的幼虫;B,危害后菌丝退化(左)与正常菌袋(右)对比。A, Larvae in the fungus bag; B, Damaged bag (left) and normal bag (right).图7 危害症状图Fig.7 Damage characteristics

研究结果表明,Bradysiaperaffinis是危害江西省茶树菇的一种蕈蚊,为江西省新纪录种。本文描述了其形态特征,明确了其遗传距离、发育历期、生活史和危害规律等。

有关B.peraffinis的报道较少,Shin等[14]将迟眼蕈蚊属幼虫的栖息地分为3种类型:活的植物体、腐木和枯枝落叶,B.peraffinis幼虫栖息地大多为活的植物体,少部分为腐木。张丹凤等[13]的调查表明,在湖北省远安县发现该虫危害香菇。Shin等[15]在韩国的橡树木屑栽培的香菇中发现该虫,但都未详细研究其形态特征、生活史、危害规律等。本文首次明确了其发育历期、生活史,并发现B.peraffinis为江西省新纪录种。

茶树菇虽然为江西省的主栽品种,年产量排全国第一名[16],但是江西省对茶树菇病虫害防控技术的研究十分薄弱,在江西省尚未有B.peraffinis的分布记录,也无其危害茶树菇的相关报道。茶树菇能散发特殊的香味,因而易吸引害虫危害[4],但对其具体危害种类的相关记录却不多。张宏瑞等[12]报道异迟眼蕈蚊Bradysiadifformis对茶树菇的危害较严重。郝姗姗[17]报道,异迟眼蕈蚊Bradysiaimpatiens在茶树菇上可以正常完成生长发育。本研究首次发现,B.peraffinis也可危害茶树菇,为茶树菇上该虫的鉴定提供了依据,也提醒了昆虫学家和农民注意这一对茶树菇具有重要经济意义的潜在害虫,为该害虫的综合防控奠定基础。

我国的茶树菇栽培以自然环境的农法栽培为主,栽培条件较落后,病虫害发生严重[18]。本研究的试虫均为培养箱内饲养所得,而菇房生存环境更为复杂,且有关B.peraffinis的分布、食性、适生环境等研究未有报道,因此,后续应加强对B.peraffinis发生规律的进一步研究,探索综合防治措施,以期实现该虫的绿色防控。

致谢:感谢浙江省柑橘研究所吕佳研究实习员、江西省农业科学院植物保护研究所孙杨副研究员和曾荣研究实习员对本文的指导、帮助。

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