雷公藤甲素调控p53/SLC7A11,轴诱导结肠癌细胞铁死亡

徐嘉韩 陆新刚

结直肠癌是常见且高发的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居高不下[1]。2020 年全球新发结直肠癌病例超过188 万例，居恶性肿瘤第三位[2]。结肠癌在中老年人群中发病率较高，已有超过直肠癌的趋势[3]。目前结肠癌的治疗策略是手术切除联合术后辅助化疗。随着中医药在肿瘤领域的不断发展，结肠癌手术联合放化疗期间适时介入中医辨证施治，可减轻放化疗毒副作用，提高手术疗效[4]。雷公藤甲素作为传统中药雷公藤的主要有效成分，是一种三环氧二萜内酯类单体化合物，又名雷公藤内酯醇[5]。相关研究表明，雷公藤甲素具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性[6]。在肿瘤应用领域，雷公藤甲素抗癌活性具有广谱、高效的特点，可抑制包括宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、胰腺癌及前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞的生长[7-8]。而目前雷公藤甲素对结肠癌的抗癌机制尚未十分明确，本研究通过探讨雷公藤甲素抗结肠癌的分子机制，为临床应用提供理论依据，现报道如下。

1.1 材料与仪器

1.1.1 细 胞 人结肠癌细胞（HCT116）购自中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂 雷公藤甲素（批号HY-32735）购自美国MCE 公司；
胎牛血清（批号16140089）、McCoy"s 5A 培养基（批号16600082）购自美国赛默飞公司；
丙二醛（MDA）试剂盒（批号JL-T0761）、Fe2+离子检测试剂盒（批号JL-T1118）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量试剂盒（批号JL-T0906）均购自上海江莱生物；
线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（批号M8650）购自北京索莱宝科技有限公司；
一抗p53（批号2527S）、SLC7A11（批号98051S）、β-actin（批号4970S）抗体均购自美国CST 公司。

1.1.3 主要仪器 高速冷冻离心机（型号：Sorvall Legend Micro）、酶标仪（型号：LabServ K3）购自美国赛默飞公司；
电泳仪（型号：165-8033）、转印槽（型号：170-3930）购自美国Bio-Rad 公司；
荧光倒置显微镜（型号：TiS）购自日本尼康公司；
流式细胞仪（CytoFlex S）超速离心机（Optima XPN-100）购自美国Beckman 库尔特公司。

1.2 细胞培养与分组 HCT116 细胞铺于T25 细胞培养瓶中，使用含10%胎牛血清的McCoy"s 5A 培养基，在5% CO2、37 ℃条件下培养。使用雷公藤甲素（0、1、2、5、10、20、40、80、160 nmol/L）干预HCT116细胞，分为对照组和雷公藤甲素组，每组设3 个复孔。

1.3 CCK-8 检测 取对数生长期（80%细胞融合度）的HCT116 细胞接种于96 孔板中（5×103/孔），按实验方案干预后加入CCK-8 溶液，CO2培养箱孵育2 h，去上清后加入二甲基亚砜（DMSO），最后使用酶标仪检测450 nm 处的吸光度。数据分析，HCT116 细胞活力（%）=（OD450实验组-空白组）/（OD450对照组-空白组）×100%。

1.4 EdU 细胞增殖检测 取对数生长期的HCT116细胞接种于96 孔板中（5×103/孔）。采用胸腺嘧啶核苷类似物（EdU）试剂A 标记细胞，孵育2～4 h 后在4%多聚甲醛中固定30 min，并用0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透10 min，最后在Apollo 染色反应液中37 ℃避光条件下孵育30～60 min，荧光倒置显微镜下观察细胞增殖活性。

1.5 平板克隆实验 取对数生长期的HCT116 细胞，胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，细胞计数后以500 个细胞/孔的密度接种于培养皿，继续培养到14 d 后进行结晶紫染色，拍照。

1.6 铁死亡相关指标检测 取对数生长期的HCT116 细胞，根据实验方案干预细胞，根据生化检测试剂盒说明书步骤，测定细胞中Fe2+、GSH、MDA含量。

1.7 ROS 检测 2"，7"-二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）法检测ROS 水平。取对数生长期的HCT116 细胞，使用DCFH-DA 荧光探针标记HCT116 细胞，DCFH 可被细胞中ROS 氧化生成荧光物质2"，7"-二氯荧光素（DCF），应用流式细胞仪检测DCF 荧光强度。

1.8 线粒体膜电位检测 配置JC-1 染色工作液，加入1 mL 工作液至6 孔板中，与铺板细胞充分混匀，在CO2培养箱中37 ℃孵育20 min。孵育结束后，在荧光倒置显微镜下观察。

1.9 Western blot 检测 使用RIPA（强效）裂解液裂解HCT116 细胞，收集细胞总蛋白进行2-2-联喹啉-4、4 二甲酸二钠（BCA）法蛋白定量。蛋白经过十二烷基？酸钠-聚内烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯（PDVF）膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后与一抗（p53，1 ∶1000，SLC7A11，1∶1000，β-actin，1∶1000，）在4 ℃摇床孵育过夜，最后与偶联辣根过氧化物酶的二抗（1∶10000）反应1 h，通过ECL 增强型化学发光试剂显影条带。

1.10 统计学方法 应用SPSS 26.0 软件统计分析，使用GraphPad Prism 9.0 制作统计图。计量资料符合正态分布以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间数据比较采用独立样本t 检验，若方差同质性检验发现方差不齐采用Tamhane"s T2 检验进行两两比较。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.1 雷公藤甲素抑制HCT116 细胞活力 不同浓度雷公藤甲素处理HCT116 细胞24 h，发现细胞活力成梯度依赖性降低（P＜0.05），见表1；
其半抑制浓度（IC50）为47.82 nmol/L。

表1 不同浓度雷公藤甲素对HCT116 细胞活力的影响（%，）

表1 不同浓度雷公藤甲素对HCT116 细胞活力的影响（%，）

注：0，1，2，5，10，20，40，80，160nmol/L 为不同浓度雷公藤甲素干预24h；
IC50=47.82 nmol/L；
IC50 为半抑制浓度；
与0 nmol/L 组比较，aP＜0.05

2.2 雷公藤甲素抑制HCT116 细胞增殖与克隆能力EdU 细胞增殖实验发现，雷公藤甲素处理后，细胞增殖活性较对照组显著降低（P＜0.05）（见图1A）；
同时平板克隆形成实验显示，雷公藤甲素可显著抑制HCT116 细胞克隆形成能力（P＜0.05），见图1B。

图1 HCT116 细胞增殖与克隆能力检测

2.3 雷公藤甲素诱导HCT116 细胞铁死亡 铁死亡相关指标检测发现，雷公藤甲素处理后HCT116 细胞中Fe2+离子、MDA 水平升高，GSH 含量降低（P＜0.05）（见表2）；
流式细胞术显示，雷公藤甲素可显著增加HCT116 细胞ROS 水平（P＜0.05），见图2。

图2 HCT116 细胞活性氧自由基ROS 水平检测

表2 HCT116 细胞铁死亡相关指标检测（）

表2 HCT116 细胞铁死亡相关指标检测（）

注：对照组为常规条件培养24 h；
雷公藤甲素组为40 nmol/L 雷公藤干预24 h；
Fe2+为亚铁离子；
MDA 为丙二醛；
GSH 为谷胱甘肽；
与对照组比较，aP＜0.05

2.4 雷公藤甲素抑制HCT116 细胞线粒体膜电位细胞铁死亡早期可出现线粒体膜电位下降，本研究采用JC-1 荧光探针检测HCT116 细胞线粒体膜电位。在荧光显微镜下成功观察到线粒体JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变，证实雷公藤甲素可引起细胞线粒体膜电位下降。见图3。

图3 HCT116 细胞线粒体膜电位检测（200X）

2.5 雷公藤甲素调控HCT116 细胞p53、SLC7A11蛋白表达 Western blot 结果显示，与对照组相比，雷公藤甲素干预后HCT116 细胞p53 蛋白表达增加，SLC7A11 蛋白表达降低（P＜0.05）。见图4。

图4 Western blot 检测HCT116 细胞p53、SLC7A11 蛋白表达注：对照组为常规条件培养24 h；
雷公藤甲素组为40 nmol/L雷公藤干预24 h

雷公藤甲素从1972 年首次分离以来，因其具备较强的免疫调节、抗炎和广谱高效的抗肿瘤等多种药理学活性而备受关注[8]。随着雷公藤甲素药理学机制研究的深入，已证实它可通过调控细胞周期、凋亡与自噬平衡、细胞迁移与侵袭、介导肿瘤免疫逃避等多种方式发挥抗癌作用[9]。本研究通过CCK-8 检测发现，雷公藤甲素可明显抑制HCT116 细胞活力，且呈浓度梯度依赖性，其半抑制浓度IC50 为47.82 nmol/L。EdU 细胞增殖检测与平板克隆形成实验进一步证实了雷公藤甲素可抑制HCT116 细胞增殖克隆能力。

铁死亡是一种在Fe2+离子参与下，因铁依赖性ROS 的异常堆积而发生脂质过氧化，最终引起细胞死亡的新型死亡方式[10]。细胞铁死亡的形态学特征主要表现为线粒体皱缩、线粒体嵴减少或消失、线粒体外膜破裂及膜电位破坏[11]。相关研究显示，铁死亡参与多种肿瘤的发生发展，诱导肿瘤细胞铁死亡可抑制其持续激活的增殖信号，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤转移，有望作为癌症治疗中的一个可以靶向的弱点[12]。基于此，本研究推测雷公藤甲素可能可诱导HCT116 细胞铁死亡，抑制肿瘤细胞增殖与克隆。通过铁死亡相关指标检测发现，经雷公藤甲素处理后，HCT116 细胞Fe2+离子、MDA 水平及ROS 水平显著升高，GSH 含量降低；
并通过JC-1 探针成功观察到HCT116 细胞线粒体膜电位下降。

铁死亡受到细胞内多条信号通路严密调节，主要受到胱氨酸/谷氨酸逆转运体（System xc-）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的严格调控[13]。System xc-作为细胞内重要的抗氧化体系，是由SLC7A11 和SLC3A2 组成的异二聚体，其中SLC7A11 亚基负责主要的转运活性[14]。当System xc-体系遭受破坏可引起胱氨酸吸收降低，影响GSH 的合成，最终导致GPX4 的失活和脂质过氧化积累，从而促进铁死亡[15]。抑癌基因p53 可以通过抑制 SLC7A11 的表达来增强铁死亡[16]。为进一步诠释雷公藤甲素诱导HCT116细胞铁死亡的分子机制，本研究通过Western blot 实验初步证实，雷公藤甲素可上调 HCT116 细胞p53 蛋白表达，从而抑制SLC7A11 蛋白丰度，促进铁死亡的发生。

综上所述，雷公藤甲素可通过调控p53/SLC7A11 轴诱导HCT116 细胞铁死亡，抑制肿瘤持续激活的增殖与克隆能力。本研究虽局限于体外实验，缺乏体内实验相互佐证。

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