Cyclin,D1、P27在小鼠ARDS肺纤维化中的表达及意义*

许美霞, 周 贤, 刘 涛, 戴 仲, 许 涛

武汉市第四医院重症医学科,武汉 430033

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床上常见的急危重症,表现为急性呼吸窘迫及顽固性低氧血症,它可以由感染、创伤、休克等因素导致。ARDS每年发生率及死亡率居高不下,对于重度ARDS其死亡率甚至高达约60%[1-2]。即使是幸存者,也经常因为肺纤维化遗留显著的肺功能损害,导致运动能力下降[3-5]。研究显示,肺成纤维细胞增殖异常、胶原蛋白合成增加是ARDS肺纤维化发生的重要原因之一,而细胞周期是影响细胞增殖的重要环节[6-7]。因此,本研究采用脂多糖(LPS)诱导C57BL/6小鼠急性肺损伤及肺纤维化模型,研究细胞周期蛋白Cyclin D1、P27表达变化规律及其对脂多糖致ARDS肺纤维化的影响。

1.1 实验动物与试剂

清洁级C57BL/6雄性小鼠56只,6～8周龄,体质量20～25 g,购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)检测试剂盒购自南京建成生物研究所;Ⅰ型胶原测定试剂盒购自上海森雄生物制品公司;LPS购于上海阿拉丁生化科技有限公司;Cyclin D1、P27单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;引物合成由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 C57BL/6小鼠根据随机数字表法分为对照组(Control组)、LPS组,每组再分为造模后1、3、7、14 d亚组(T1、T3、T7、T14),每组7只。LPS组经腹腔注射LPS(5 mg/kg,0.2 mL/kg),对照组腹腔注射同等量的生理盐水,连续给药5 d,每日观察小鼠活动情况。

1.2.2 标本收集 于实验第1、3、7、14天分别从两组小鼠中随机抽取7只,2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,打开胸腔并分离肺组织。将左肺组织置于4%多聚甲醛中固定,经过脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋处理后,连续石蜡切片用于苏木精-伊红(HE)染色,右肺置于-80℃冰箱冻存,用于Ⅰ型胶原检测、Western blot及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的检测。

1.2.3 肺纤维化评分方法 根据HE染色组织病理在光镜下进行双盲肺组织纤维化程度评分。评分标准:正常肺组织为主评为0分;肺泡壁或细支气管壁轻度纤维化评为1分,2～3分为肺泡壁或细支气管壁中度纤维化而无肺泡结构的破坏;有明确的肺泡结构破坏、纤维小结或纤维条带形成评为4～5分;有重度肺泡结构破坏并大片纤维化评为6～7分;全部区域纤维化评为8分。

1.2.4 HYP含量及Ⅰ型胶原检测 取肺组织,以预冷的生理盐水洗净残血,并吸干水分,取1 g湿重的肺组织剪碎,超声粉碎匀浆,离心取上清液,按照试剂盒说明书测定Ⅰ型胶原水平。取-80℃冰箱冻存的肺叶,根据试剂盒说明书采用碱水解法测定小鼠肺组织中HYP含量。

1.2.5 肺组织Cyclin D1、P27蛋白表达检测 收集待测肺组织样品,BCA试剂盒测定蛋白浓度。用5%BSA(牛血清白蛋白)室温封闭1 h。其中一抗用5%BSA封闭液按1∶200比例稀释,4℃条件下孵育过夜。二抗用5%牛血清白蛋白封闭液按1∶2000比例稀释,室温孵育2 h。ECL显影。

1.2.6 qRT-PCR检测肺组织Cyclin D1、P27 mRNA表达 用Trizol法提取肺组织总RNA,操作按照Fermentas试剂盒说明书进行,引物序列见表1。逆转录cDNA反应条件:25℃ 5 min,50℃ 15 min,85℃ 5 min,4℃ 10 min,30个循环;72℃ 4 min,4℃ 4 min。PCR反应条件:第1循环50℃ 2 min,95℃ 10 min,然后95℃ 30 s及60℃ 30 s,共40个循环。

1.3 统计学方法

2.1 各组小鼠肺组织纤维化评分的比较

Control组在光镜下见肺泡的结构较完整且清晰,无明显炎性细胞的浸润、出血,肺泡隔无明显增宽,纤维化评分在亚组间的差异无统计学意义(P>0.05);LPS组第3、7、14天肺部炎症逐步加重,伴弥漫性炎性细胞浸润及出血,肺部结构破坏明显,肺纤维化程度逐渐加重,纤维化评分在亚组间的差异有统计学意义(P<0.05);组间比较,LPS组第3、7、14天肺组织纤维化评分较Control组明显增加,差异有统计学意义(均P<0.01)(表2、图1)。

2.2 各组肺组织HYP含量及Ⅰ型胶原水平

与Control组比较,第1天LPS组HYP、Ⅰ型胶原水平无明显差异(P>0.05);第3、7、14天LPS组HYP、Ⅰ型胶原水平较Control组呈时间依赖性增加(均P<0.01)。见图2。

表2 各组小鼠肺组织纤维化评分Table 2 Pulmonary fibrosis score of mice in each

图1 各组肺组织病理学改变(HE染色,×200)Fig.1 Pulmonary histopathological changes in each group (HE staining,×200)

与Control组比较,**P<0.01图2 各组肺组织HYP含量及Ⅰ型胶原水平Fig.2 The expression of HYP and TypeⅠcollagen in each group

2.3 各组肺组织Cyclin D1、P27蛋白表达水平

与Control组比较,LPS组第3天Cyclin D1蛋白表达增加(P<0.05),第7、14天Cyclin D1蛋白表达显著增加(均P<0.01);第3、7、14天LPS组P27蛋白表达水平较Control组明显减少(均P<0.01)(图3)。

2.4 各组肺组织Cyclin D1、P27 mRNA表达水平

LPS组第3、7、14天Cyclin D1 mRNA表达水平分别为(1.56±0.36)、(2.32±0.10)、(3.45±0.51),较Control组明显上调(均P<0.01),而P27 mRNA表达水平较Control组明显下调(均P<0.01)。见图4。

①Control组;②LPS组;与Control组比较,*P<0.05 **P<0.01图3 各组肺组织Cyclin D1、P27蛋白表达水平Fig.3 The protein expression of Cyclin D1 and P27 in each group

与Control组比较,**P<0.01图4 各组肺组织Cyclin D1、P27 mRNA表达水平Fig.4 The mRNA expression of Cyclin D1 and P27 in each group

2.5 各组肺组织Cyclin D1、P27 mRNA表达与纤维化评分的相关性

脂多糖诱导的ARDS肺纤维化小鼠肺组织中Cyclin D1 mRNA的表达与纤维化评分呈正相关(r=0.930,P<0.01),P27 mRNA表达与纤维化评分呈负相关(r=-0.881,P<0.01)。见图5。

图5 Cyclin D1、P27 mRNA表达水平与肺纤维化评分相关性Fig.5 The correlation between mRNA expression of Cyclin D1 and P27 and pulmonary fibrosis scores

在ARDS早期即开始出现肺纤维化,但其具体的机制尚不清楚。随着对ARDS研究的不断深入,发现ARDS肺纤维化与肺泡上皮细胞及肺毛细血管损伤异常修复等有关,其中肺成纤维细胞异常增生是ARDS肺纤维化的重要因素[5]。研究发现在ARDS发生早期,肺组织中肺成纤维细胞显著增加导致胶原合成明显上升[6-8]。在体外细胞实验中,用确诊ARDS患者24 h内的肺泡灌洗液刺激人肺成纤维细胞,肺成纤维细胞数量较对照组明显增加,且肺成纤维细胞增殖情况与PⅢNP含量有明显相关性,提示肺成纤维细胞在受到刺激出现异常增生时分泌前胶原,促使胶原蛋白合成增加,加速了ARDS肺纤维化发生发展的进程[7-9]。因此,肺成纤维细胞异常增生导致胶原蛋白合成增加,是ARDS患者发生肺纤维化重要发病机制。

本研究证实,脂多糖可诱导小鼠肺组织发生急性肺损伤及ARDS肺纤维化,且肺组织中Ⅰ型胶原明显增加。羟脯氨酸(HYP)主要存在于动物的胶原蛋白中,羟脯氨酸含量的变化可以反应组织中胶原蛋白合成分解代谢情况。而胶原蛋白的不断沉积是纤维化进程的主要病理表现。因此,通过检测肺组织中Ⅰ型胶原蛋白及HYP浓度变化,可以直接有效地判断肺纤维化的发展程度[10-11]。本研究发现小鼠给予脂多糖LPS干预后,肺组织中Ⅰ型胶原蛋白、羟脯氨酸含量呈时间依赖性增加,进一步提示LPS诱导ARDS肺纤维化小鼠模型成功。

细胞增殖与细胞周期的有序运行密切相关。细胞周期在各时相周期性运转期间受到多个检控点的严密调控,其中细胞周期蛋白可构成复杂的网络调节系统,参与细胞周期的调控。研究发现,在多种肿瘤组织及细胞中发现细胞周期相关蛋白表达异常。Cyclin D1为细胞周期蛋白之一,其通过与CDK4/6结合促进Rb蛋白磷酸化,并加速细胞周期从G1向S转变,造成多种肿瘤细胞异常增殖。P27可通过抑制CDK4/6-Cyclin D复合体的结合,抑制Rb蛋白磷酸化,使细胞G1期向S期转换受阻,从而参与胃癌细胞、乳腺癌等细胞增殖的调控[12-13]。也有研究发现,Cyclin D1高表达、P27低表达与肝组织纤维化、肾纤维化等疾病密切相关[14-15]。我们前期体外研究发现,用LPS刺激肺成纤维细胞,细胞明显增殖,且Cyclin D、Cyclin E表达上调,P21、P27表达下调。在本研究中我们发现,脂多糖致ARDS肺纤维化小鼠肺组织中,Cyclin D1、P27作为正常细胞周期运转的必要蛋白,在对照组中存在表达,LPS组随着时间的延长,Cyclin D1蛋白及mRNA表达逐渐上升,第3、7、14天时Cyclin D1表达较对照组明显增加,其mRNA的表达与肺组织纤维化程度呈正相关;P27表达逐渐下降,第3、7、14天时P27蛋白表达较对照组明显减少,其mRNA的表达与肺组织纤维化程度呈负相关。

综上所述,细胞周期相关蛋白异常表达与脂多糖致ARDS肺纤维化密切相关,但Cyclin D1、P27具体是如何发挥作用的还有待进一步深入地研究。

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