红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性

王俊凯 刘峥 申东晨 董爱荣

摘 要：采用Illumina Miseq高通量测序技术来探究人工林与天然林东北红豆杉（Taxus cuspidata）健康针叶与感叶枯病的病葉之间内生真菌和细菌群落结构的差异。结果表明，红豆杉针叶感病前后真菌的OTU （Operational Taxonomic Units）变化较小，细菌的OTU变化较大，天然林比人工林具有更多的真菌OTU数，细菌OTU数差距较小。4组样品中共有相同的真菌OTU 9个，占真菌OTU 总数的9.37%，4组样品中共有相同的细菌OTU 34个，占细菌OTU总数的4.19%。在门水平下，感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对多度，相比于天然林，子囊菌门（ Ascomycota ）在人工林中的相对多度更高，子囊菌门在4组样品占据绝对优势。感病前后样品中的细菌群落结构组成及相对多度都发生了较大变化，相比于天然林，人工林中细菌种类更多。在属水平下，Genolevuria属是人工林健康叶中最主要的优势真菌，穴壳属（Dothiora）是人工林病叶中最主要的优势真菌，Buckleyzyma属是天然林健康叶已知属中最主要的优势真菌，Genolevuria属是天然林病叶已知属中最主要的优势真菌。劳尔氏菌属（Ralstonia）是人工林健康叶中最主要的优势细菌，1174-901-12属是人工林病叶中最主要的优势细菌，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是天然林健康叶已知属中最主要的优势细菌，马赛菌属（Massilia）是天然林病叶已知属中最主要的优势细菌。推测出链格孢属（Alternaria）和盘双端毛孢属（Seimatosporium）可能会导致红豆杉的叶枯病。

关键词：高通量测序；
红豆杉；
叶枯病；
真菌多样性；
细菌多样性

中图分类号：S763.1    文献标识码：A   文章编号：1006-8023（2023）04-0010-09

Diversity of Endophytic Microorganisms in Healthy and Susceptible

Leaf Blight Needles of Taxus cuspidata

WANG Junkai， LIU Zheng， SHEN Dongchen， DONG Airong*

（School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：：Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to investigate the differences in endophytic fungal and bacterial community structure between healthy and diseased needles of Taxus cuspidata in artificial and natural forests. The results showed that the changes of fungal OTU （Operational Taxonomic Units） were small and the changes of bacterial OTU were large. The natural forest had more fungal OTU number than the artificial forest， and the difference of bacterial OTU number was smaller. There were 9 fungal OTUs in the four groups， accounting for 9.37% of the total fungal OTU. There were 34 identical bacterial OTUs in the four groups of samples， accounting for 4.19% of the total bacterial OTU. At the phylum level， the fungal community composition in the samples before and after infection was basically the same， but degree of relative abundance was significantly different. Compared with the natural forest， the relative abundance of Ascomycota was higher in the artificial forest. Ascomycota was dominant in the four groups of samples. The bacterial community structure and relative abundance changed greatly before and after infection. There were more bacterial species in artificial forests than in natural forests. At the genus level， Genolevuria was the most dominant fungus in healthy leaves of plantations. Dothiora was the most dominant fungus in diseased leaves of plantations， Buckleyzyma was the most dominant fungus in known genera of healthy leaves of natural forests. Genolevuria was the most dominant fungus in the known genera of diseased leaves in natural forests. Ralstonia was the most dominant bacteria in healthy leaves of plantations， 1174-901-12 was the most dominant bacteria in diseased leaves of plantations， Sphingomonas was the most dominant bacteria in known genera of healthy leaves of natural forests. Massilia was the most dominant bacterium in the known genus of natural forest leaf disease. It was speculated that Alternaria and Seimatosporium may cause leaf blight of Taxus cuspidata.

Keywords：High-throughput sequencing; Taxus cuspidate; leaf blight; fungal diversity;bacterial diversity

收稿日期：2022-10-08

基金项目：国家自然科学基金项目（31670494）

第一作者简介：王俊凯，硕士研究生。研究方向为森林病理学。E-mail：
wangjk19970912@163.com

通信作者：董爱荣，博士，副教授。研究方向为森林病理学。E-mail：
darlmy@tom.com

引文格式：王俊凯，刘峥，申东晨，等. 红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性[J].森林工程，2023，39（4）：10-18.

WANG J K， LIU Z， SHEN D C， et al. Diversity of endophytic microorganisms in healthy and susceptible leaf blight needles of Taxus cuspidata[J]. Forest Engineering， 2023，39（4）：10-18.

东北红豆杉（Taxus cuspidata）为红豆杉属（Taxus）植物，是珍贵的第三纪孑遗树种[1]，为国家一级重点保护树种[2， 3]，具有极高的经济价值、观赏价值和生态效益[4]。东北红豆杉终年常绿，是优秀的园林绿化树种，可以吸附有害气体，释放植物精气，驱蚊防虫，抗病虫害能力强[5-6]。在 20 世纪 70 年代，Wani等[7]的研究团队在对名为短叶红豆杉（Taxus brevifolia）的植物成分进行研究后，成功提取出具有较为明显抗癌效果的紫杉醇，红豆杉属植物便成为众多学者研究热点。东北红豆杉由于其地理环境以及气候因素的特殊条件，紫杉醇的平均含量明显高于其他种的含量[8-9]。东北红豆杉天然种群本身生长较缓慢，天然结实率低，且对生长环境要求较严，种群竞争力较弱[1， 10]，再加上外界环境影响，东北红豆杉天然林已濒临灭绝，其保护形势十分严峻[11-13]。

红豆杉叶枯病会给东北红豆杉带来严重的经济损失[14]。2021年在黑龙江省穆棱市穆棱镇人工林内发现了红豆杉叶枯病的发生，经调查发现，该病害在染病针叶上发病，并最终导致针叶枯死。近些年来，随着生物防治的逐渐完善，运用植物内生菌拮抗病原菌来防治叶枯病自然是一种较为可行的方法[13， 15]。高通量测序能够更为准确快捷了解微生物的性质及其在自然界中的生态功能，通过高通量测序技术能够一次性检测出样品中可能感染的多种病原物基因组序列， 对病原检测鉴定具有很好的应用[16- 17]。本研究基于高通量测序技术，分析人工林与天然林感红豆杉叶枯病与健康针叶内生微生物的多样性以及群落结构的变化，探知优势微生物的分布，从而可用于指导筛选红豆杉针叶内生优势的叶枯病拮抗菌，并探究人工林与天然林内生微生物的差异[18-20]。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

采样地点位于黑龙江省穆棱市穆棱镇东北红豆杉人工林及天然林。东北红豆杉天然林25 hm2样地，位于穆棱东北红豆杉国家级自然保护区内（43°49′～44°06′ N，130°00′～130°28′ E）。样地地形走势西南高，海拔最高781 m，最低658 m，高差123  m；
年平均温度在-2  ℃，年平均降水量530  mm，土壤为暗棕壤。样地内森林群落优势种明显，垂直层次复杂，是典型的中龄复层异龄林，其主要建群树种为紫椴（Tilia amurensis）、红松（Pinus koraiensis）、臭冷杉（Abies nephrolepis）和枫桦（Betula costata）等，样地内共有胸径（DBH）大于等于1 cm木本植物57种，隶属于22科38属。独立个体数为63 877株，平均胸径为7.83  cm，胸高断面积26.4  m2。样地内现有东北红豆杉（Taxus cuspidate）成树169株，天然更新幼苗350～450株。

东北红豆杉人工林（43°45′ N，131°00′ E）约4 hm2，1995年营建， 土壤为暗棕壤，东北红豆杉20 a以上开始结实，40 a以上果实质量高，株行距为2.5  m×3  m，主要建群树种为落叶松（Larix gmelinii），样地内现有东北红豆杉共计一百多万株。

1.2 试验材料

本实验分别于人工林及天然林采集健康红豆杉及感叶枯病红豆杉针叶。2021 年6月18日至20日，采用“S”形十点采样法，分别剪取 10 棵 15年生健康及感叶枯病红豆杉针叶。从 10 棵树上采集的样品中分别选取 1.0  g，用无菌剪刀剪碎，将其混匀后，使用75%乙醇表面消毒1  min，无菌水冲洗1次，再使用5%（有效氯）次氯酸钠溶液表面消毒5 min，无菌水冲洗3次，从而得到人工林及天然林各 10.0  g 健康樣品及 10.0  g 感病样品。穆棱镇人工林健康样品、感叶枯病样品分别用S1、L1表示；
穆棱镇天然林健康样品、感叶枯病样品分别用S2、L2表示。将样品分别置于2  mL的无菌离心管中并于－80  ℃的超低温冰箱中保存至DNA提取。

1.3 红豆杉内生微生物基因组 DNA 的提取及质量检测

红豆杉样品的基因组DNA参照 MP 试剂盒 Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200 的使用说明书进行提取，将所提取到的 DNA 溶于50  μL无菌水中，混合均匀，置于－80  ℃保存备用。之后使用NanoDrop2000进行基因组DNA浓度及纯度检测，使用琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA完整性检测。

1.4 PCR扩增和高通量测序

利用提取的 DNA进行PCR扩增，真菌选择ITS1 和ITS2R 作为引物，分别为 5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′和 5′－GCTGCGTTCTTCATC-GATGC－3′；
细菌选择 799F 和 1193R 作为引物，引物序列分别为 5′－AACMGGATTAGATACCCKG－3′和 5′－ACGTCATCCCCACCTTCC－3′。将其送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，利用 Illumina MiSeq 平台进行测序和数据分析。

1.5 数据分析

下机数据经过 QIIME（ v1．8．0） 软件过滤、拼接和去除嵌合体，去除各样本中reads 尾部质量值在 20 以下的碱基、切除 reads 中含N 部分序列，并去除数据中的短序列（ 长度阈值 200  bp） ，随后再对低复杂度的序列进行过滤。采用Usearch（ v7.1） 软件进行数据处理，物种比对注释使用RDP classifier 软件，保留置信区间大于0.8 的注释结果。用R语言工具绘制稀释性曲线、韦恩（Venn）图、群落结构图及主坐标分析图（Principal Co-ordinates Analysis，PcoA）。利用 Mothur 软件（version v.1.30.2 http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_diversity）进行 Chao1 （估计物种总数）指数、香农指数（ Shannon）、气旋能量指数（Accumulated cyclone energy， Ace）、辛普森（Simpson）指数、Coverage（覆盖度）指数计算分析，并在各分类水平上进行群落结构的统计分析，得到微生物群落结构组成。生境内的多样性指数 （within-habitat diversity，Alpha）可用来反映生物群落的丰富度和多样性。其中，Ace、Chao1指数可反映生物物种的丰富度，其数值越大表示该样品物种丰富度越大，其中Ace指数用来估计样本中物种组成的均匀度的指数，Chao1指数用来估计样本中所含OTU（Operational Taxonomic Units）数目的指数；
Shannon、Simpson指数可以反映生物群落的多样性，其中Shannon指数用来衡量群落的异质性，其数值越大表示群落多样性越高，Simpson指数代表随机取样的2个体属于不同种的概率，其数值越大表示群落物种分布越均匀；
Coverage指数则可以反映生物群落的覆盖度，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。生境间多样性 （between-habitat diversity，Beta）分析通过对不同微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析，探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。

2 结果与分析

2.1 测序质量分析

通过对人工林及天然林健康红豆杉及感叶枯病红豆杉针叶4种样品进行高通量测序数据统计，S1、L1、S2、L2分别得到102 022、87 750、100 624、65 973条有效真菌序列及16 090、15 336、18 905和15 983条有效细菌序列，采用对测序获得的序列进行随机抽样的方法， 以抽到的序列数与其所代表的OTU数构建稀释曲线（图1）。由图1可以看出，4种针叶内生微生物的稀释曲线均趋于平坦，表明测序数据能很好地反映各样品中真菌及细菌的群落结构和多样性，更多的测序数据对发现新的OTU贡献率较小。

将测序所得的有效序列按97%的相似度进行OTU的划分后整理绘制的Venn图（图2）。由图2（a）可知，在4组处理中检测到的真菌总OTU数为950个，其中S1组有222个、L1组有204个、S2组有306个、L2组有218个。4组样品中共有相同的OTU89个，占 OTU 总数的9.37%，4组样品中特有的 OTU 数目分别为58、17、74、31个；
由图2（b）可知，在4组处理中检测到的细菌总OTU数为811个，其中S1组有274个、L1组有121个、S2组有279个、L2组有137个。4组样品中共有相同的OTU34个，占 OTU 总数的4.19%，4组样品中特有的 OTU 数目分别为144、17、100、17个，以上结果表明天然林比人工林具有更多的真菌与细菌OTU数，细菌OTU数量差距较小；
感病后，针叶的真菌与细菌OTU数量减少。

2.2 感病前后红豆杉针叶的微生物群落门类组成

在97％的相似度水平对样品序列进行OTU聚类，由表1可知，4组红豆杉针叶微生物多样性丰富，将不同样品中相同的真菌进行合并，共鉴定得出真菌6个门、24个纲、71个目、164个科、300个属、427个种，将不同样品中相同的细菌进行合并，共鉴定得出细菌23个门、47个纲、104个目、161个科、248个属、350个种。其中，人工林健康针叶与天然林健康针叶的真菌及细菌种类数量明显高于人工林感病针叶与天然林感病针叶（人工林健康针叶的真菌种类数量稍高于人工林感病针叶）。

在相似水平为97%的条件下，与16S嵌合体数据库（Gold database）及ITS嵌合体数据库：（UNITE）对比，对所得序列进行聚类分析， 图3为感病前后人工林与天然林内生真菌和細菌在门水平上的群落结构特征（物种多度占比大于0.1%的门）。由图3（a）可知，从真菌分类门水平看，人工林和天然林4种样品检测出3个相对多度较高的真菌类群，即：
子囊菌门（ Ascomycota）、担子菌门（ Basidiomycota）及未鉴定出的真菌（ unclassified_k__Fungi）。其中S1、L1、S2和L2中子囊菌门的相对多度依次降低，担子菌门的相对多度依次升高。S1 和L1中Ascomycota的相对多度分别为83.02%与78.81%，明显高于S2和L2；
S2和L2中unclassified_k_Fungi的相对多度分别为29.95%与33.37%，明显高于S1和L1。结果表明，在门水平下，感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对多度；
相比于天然林，Ascomycota在人工林中的相对多度更高。

由图3（b）可知，从细菌分类门水平看，人工林和天然林4种样品主要检测出6个相对多度较高的细菌类群，即：
变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、粘球菌门 （ Myxococcota）和酸杆菌门（ Acidobacteriota）。其中Proteobacteria与Actinobacteriota为4组针叶共有的优势细菌，S1、L1、S2和L2中Proteobacteria的相对多度分别为67.44%、35.26%、52.24%和86.29%；
Actinobacteriota的相对多度分别为8.14%、58.38%、41.39%和11.38%。Myxococcota为L1 及S2共有的优势细菌，分别占比4.74%和4.66%。Firmicutes与Bacteroidota只在S1中为优势细菌，Acidobacteriota只在L1中为优势细菌。结果表明，在门水平下，感病前后样品中的细菌群落结构组成及相对多度都发生了较大变化；
相比于天然林，人工林中细菌种类更多。

根据物种分类结果，由于样品中所检测出的真菌及细菌种类繁多，许多物种含量很少，因此筛选出优势物种，并对优势真菌及優势细菌进行分类统计并将在2组样品中含量均小于1%的物种合并至其他类别。由图4（a）可知，从真菌分类属水平看，Genolevuria属为S1、L1、S2和L2中共有的优势真菌，占比为4.97%～16.62%。S1中特有的优势真菌为尾孢属（Cercospora）、副孢霉属（Paramycosphaerella）、柱隔孢属（Ramularia）、Mycodiella属、膜盘菌属（Pezoloma）、小荚孢腔菌属（Sporormiella）和Arthrocatena属；
L1中特有的优势真菌为链核盘菌属（Monilinia）、穴壳属（Dothiora）和白孔座壳菌属（Leucostoma）；
S2中特有的优势真菌为Buckleyzyma属和Retiarius属；
L2中特有的优势真菌为银耳属（Tremella）、酵母菌属（Mrakia）、弯担菌属（Curvibasidium）、附球菌属（Epicoccum）、褐银耳属（Phaeotremella）、镰孢属（Fusarium）和赤霉菌属（Gibberella）。健康样品S1和S2中特有的真菌为维希尼克氏酵母属（Vishniacozyma）、柱隔孢属（Ramularia）、Dioszegia属和Arthrocatena属；
感病样品L1和L2中特有的真菌为链格孢属（Alternaria）和盘双端毛孢属（Seimatosporium）；
人工林样品S1和L1中特有的真菌为外囊菌属（Taphrina）、短梗霉属（Aureobasidium）、亚隔孢壳属（Didymella）和Claussenomyces属；
天然林样品S2和L2中特有的真菌为Buckleyzyma属、多臂菌属（Trichomerium）和Retiarius属。

由图4（b）可知，4组样品中的细菌群落结构组成不尽相同，且相对多度的差异也较大。从细菌分类属水平看，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）为S1、L1、S2和L2中共有的优势细菌，占比分别为1.94%、2.71%、14.23%和6.42%。S1中特有的优势细菌为劳尔氏菌属（Ralstonia）、克雷伯菌属（Klebsiella）、地芽孢杆菌属（Geobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、代尔夫特菌属（Delftia）、噬氢菌属（Ottowia）、大肠埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）、湖沉积杆菌属（Limnobacter）、norank_f__PHOS-HE36属、黄杆菌属（Flavobacterium）、Clostridium_sensu_stricto_8属和亚硝化单胞菌（Nitrosomonas）；
L1中特有的优势细菌为内杆菌属（Endobacter）；
S2中特有的优势细菌为动球菌属（Kineococcus）、中村氏菌属（Nakamurella）、湖沼菌属（Limnohabitans）、norank_f__norank_o__Gaiellales属、Klenkia属和诺卡氏菌属（Nocardioides）；
L2中特有的优势细菌为嗜酸菌属（Acidiphilium）。健康样品S1和S2中特有的细菌为劳尔氏菌属（Ralstonia）、贪噬菌属（Variovorax）、拟杆菌属（Bacteroides）、中村氏菌属（Nakamurella）、湖沼菌属（Limnohabitans）、norank_f__norank_o__Gaiellales属和Klenkia属；
感病样品L1和L2中特有的细菌为嗜酸菌属（Acidiphilium）；
天然林样品S2和L2中特有的细菌为弗莱德门菌属（Friedmanniella）和克雷伯菌属（Klebsiella）。

2.3 群落结构多样性分析

2.3.1 Alpha多样性

由表2可知，本研究将相似度为97%的序列划分为1个 OTU，进行多样性指数计算，并以5个衡量指数详细列出了4组样品中微生物的丰富度和多样性分布情况。所有样品真菌及细菌的覆盖度（Coverage）均超过 99.67%，表明真菌及细菌的测序深度已达到较高水平，数据可靠。

感病前后人工林与天然林4组红豆杉针叶样品中真菌与细菌群落的 Alpha 多样性指数部分有差异。

4组样品的真菌与细菌群落中S2（天然林健康样品）的 Chao1指数最高，即测得OTU 数最高，其次分别为 L2（天然林感病样品）、S1（人工林健康样品）和L1（人工林感病样品），样品S1及L1的Chao1指数差异不显著，Ace多样性指数所表现的多样性规律与 Chao1多样性指数结果一致。表明天然林样品的真菌与细菌丰富度指数高于人工林样品；
在天然林及人工林中，健康样品的真菌与细菌丰富度指数高于感病样品，但人工林健康样品与感病样品相差不大。

4组样品的真菌与细菌群落中S1的 Shannon指数最高，其次分别为 S2、L2、L1，4组样品的真菌与细菌群落中Shannon指数均差异较大，Simpson多样性指数所表现的多样性规律与Shannon多样性指数结果相反。表明健康样品的真菌与细菌多样性指数高于感病样品；
相比于天然林，在人工林中，健康样品的真菌与细菌多样性指数明显高于感病样品。

2.3.2 Beta多样性

PCoA分析可用来研究样本群落组成的相似性或差异性，此分析以点的形式将多组数据的差异性反映在二维坐标图上，点与点之间距离的远近代表样品中群落的差异程度。由图5可以看出，S1与L1、S2与L2的微生物构成差距较大，即同地区健康与感病样品的微生物构成差距较大；
S1与S2、L1与L2的微生物构成差距较大，即不同地区同为健康与感病样品的微生物构成差距也较大。

3 讨论

本研究通过Illumina MiSeq测序平台，分别对人工林与天然林红豆杉健康叶和感叶枯病针叶内生微生物的群落结构进行了分析，用数据说明了上述两者之间共生细菌和真菌群落结构的差异。关于病害对微生物群落的影响，Wei等[21]发现病原菌侵染微生物群落会导致群落的多样性下降，而本研究得出了相同结論：健康针叶的Ace、Chao1及Shannon多样性指数均高于感病针叶，可能是病原菌侵入破坏了原有微生物群落的平衡。

本研究发现，相比于健康样品，人工林与天然林感病样品中特有的真菌为链格孢属（Alternaria）和盘双端毛孢属（Seimatosporium）。目前盘双端毛孢属（Seimatosporium）已记录有38种，这一属中的某些种可以致病，比如大白花杜鹃病害[22]。商娜等[23]确定白三叶草叶斑病病原菌为乔木链格孢（Alternaria arborescens），杨志英等[24]确定茶叶斑病病原菌为长柄链格孢菌（Alternaria longipes），刘俏等[25]确定樱桃叶斑病病原菌为链格孢（Alternaria alternata），目前链格孢属真菌已记录有500多种，且95%寄生在不同植物上，链格孢属真菌寄主范围广，侵染能力强并且危害程度大。通过分析发现链格孢属（Alternaria）和盘双端毛孢属（Seimatosporium）可能为红豆杉叶枯病的病原菌。

利用内生菌进行植物病害生物防治是近年来的研究热点之一。研究发现，贪噬菌属（Variovorax）在土壤与植物环境中广泛分布，且该菌具有固氮作用，目前并未作为致病病原细菌被发现，陈丹[26]发现Variovorax可以作为拮抗菌抑制灰葡萄孢霉菌。故接下来的研究方向可以着重研究Variovorax对于病原菌属的拮抗能力及拮抗原理。

4 结论

红豆杉发生红豆杉叶枯病后，感叶枯病病叶与健康叶相比，细菌、真菌的多样性及物种总数都显著下降，在门及属水平上差异都较为显著；
天然林比人工林具有更多的真菌与细菌物种数，细菌物种数差距较小。本研究确定了人工林与天然林内生微生物的群落结构组成及相对多度，明确了感病前后，病叶与健康叶在门与属水平上的具体差异，推测出链格孢属（Alternaria）和盘双端毛孢属（Seimatosporium）可能会导致东北红豆杉的叶枯病，并通过查阅文献，确定了一种可能拮抗病原菌的细菌：贪噬菌属。研究结果为接下来拮抗菌拮抗红豆杉病的研究与应用奠定了基础。

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