贵州引种香榧(雌)雄球花发育及小孢子发生研究

任少华, 张驰强, 周鑫伟, 王 陈

(贵州省植物园, 贵阳 550004)

香榧(TorreyagrandisFort. ex Lindl. cv. Merrillii)系红豆杉科榧树属,雌雄异株,是经人工培育的我国特有珍稀干果,集果用、药用、油用、材用、绿化等一体的综合性经济树种,浙江、安徽、江西、湖北等地为主要种植区。目前,香榧的相关研究主要集中在食用、品种选育、转录组测序、病虫害防治[1-5]等领域。余象煜等[6]、汤仲埙等[7]虽然在生殖生物学方面做了相关研究,但贵州省作为香榧引种地,对于引种后的雄球花发育规律等未见相关报道。

有性繁殖是香榧人工造林、杂交育种等的主要方法之一,由于香榧雌雄异株,种子有深度休眠现象,并且树体童期较长[8-9],现香榧多以人工嫁接繁殖为主,但是嫁接所用接穗常从少数具有优良性状的植株采集,繁育苗木易出现共祖现象,削弱种群间遗传多样性。

因此,本研究以香榧基地的优良植株为试验材料,采用石蜡切片技术,以引种后的香榧小孢子叶球发育和小孢子的发生为研究区域,拟探讨香榧雄株在引种地的开花特征,为其生殖生物学、生殖期管理以及今后的杂交育种研究奠定基础[10-11]。

1.1 试验材料和试验地概况

试验材料为贵州省植物园香榧良种采穗圃内的优质雄株。贵州省植物园位于贵阳市北郊7 km处鹿冲关,地处中亚热带,地理位置为北纬26°34′,东经106°42′,海拔1 210～1 411 m。年平均气温为14 ℃,最冷月1月份平均气温4.6 ℃,极端最低气温-6.4 ℃,最热月7月份平均气温23.8 ℃,极端最高气温32.1 ℃,年平均降水量1 200 mm,年平均相对湿度80%,无霜期289 d,全年日照时数1 174 h。园区土壤有成土母岩为白云质石灰岩、砂岩发育的黄壤,pH值为5～7。

1.2 试验方法

香榧小孢子叶球外观形态观测,对试验所选样株进行观察,记录其生长、发育过程。

样本采集。小孢子叶球首次出现后,每月采集观测株不同方位,生长良好的10～15个小孢子叶球。花芽分化与小孢子发生早期,每3 d采样;减数分裂期,每天采样。带回实验室后,放入冰箱4 ℃保存,备用。运用常规切片制作方法制作石蜡切片,水洗。番红固绿染色,制作中性树胶封片,显微镜镜检,利用相机(日本尼康,NIKON DS-U 3)采集图像。

2.1 小孢子叶球生长、发育

经试验观测发现,香榧在5月中下旬至6月初形成小孢子叶球(图1 A),一般长在一年生的嫩枝上,从叶腋中凸起,大小约2 mm。7月下旬至8月下旬,花枝上小孢子叶球开始发育(图1 B),顶端变圆,但仍被芽鳞紧裹,苞片与芽鳞界限明显,但体积仍然很小,营养芽顶端较尖;9—12月为小孢子叶球生长旺盛期,鳞片分化结束,小孢子叶球中轴迅速伸长,在中轴由下而上分化小孢子叶原基(图1 C、D)。至翌年2月中下旬,体积逐步增大,小孢子叶球从紧包的芽鳞中显现(图1 E)。3月中下旬至4月,小孢子叶球成熟,体积变化不明显。小孢子叶球生长、发育过程中,其颜色由浅绿色逐渐变为浅黄色、黄褐色(图1 F)。4月上、中旬发育为成熟花粉粒,花粉粒无气囊,小孢子叶轴伸长,将成熟的小孢子囊推出,香榧开始散粉(图1 G)。

注:A为小孢子叶球初现;B为小孢子叶球开始发育;C、D为小孢子叶球生长旺盛时期;E为小孢子叶球成熟时期;F和G为散粉期。

香榧雄球花发育周期可以分为花芽期、膨大现蕾期、变色期、成熟散粉期等几个阶段。

1) 花芽期:5月下旬至翌年2月上旬,由绿色芽鳞紧包的小孢子叶球,单生或顶生于当年生新枝叶腋,苞片包被。形态上,这个时期的小孢子叶球只是体积的变大。

2) 膨大现蕾期:2月中、下旬至3月中下旬,小孢子叶球开始生长,伸出苞片,膨大;小孢子叶球从紧包的芽鳞中显现,当芽鳞松开后,呈放射状分布的花蕾(即小孢子叶)裸露,小孢子囊出现,这一过程称之现蕾。

3) 变色期:3月下旬至4月上旬,小孢子囊仍然紧密相连,而颜色由绿变黄,小孢子叶呈深绿色。

4) 成熟散粉期:4月上、中旬,紧接变色期之后,小孢子球全部变为黄色,小孢子叶相互分离,小孢子囊裂开,花粉完全成熟,随即成熟散粉。小孢子球内的小孢子囊开裂,进入散粉阶段。散粉期间,根据散出的花粉量多少,也可细分为3个时段。a初粉期:黄色小孢子球全部显露,个别小孢子囊开裂,散出少量花粉。b盛粉期:全部小孢子囊裂口大开,散出大量花粉。c末粉期:花粉基本散尽,花枝上的小孢子叶球变为黄褐色,呈枯萎状态。

小孢子叶球由9～20个、呈放射状排列在中轴上的小孢子叶组成,外被苞片(图2 A)。小孢子叶包含3～4个小孢子囊,排列在小孢子叶尖端(图2 B)。

香榧小孢子叶球生长发育进程中,其外部的物候形态表征与内部花粉发育是相互对应进行的。

2.2 小孢子发生

香榧小孢子发生的过程如图3所示。小孢子叶球原基发生在5月中下旬至6月上旬,小孢子叶球中轴及其基部的鳞片分化时期(图3 A)。从此时起到8月上、中旬(图3 B),鳞片分化结束,小孢子叶球中轴快速伸长,在中轴上由下而上分化小孢子叶原基,最初为一团圆形、细胞质很浓的分裂细胞。9月上、中旬小孢子叶原基迅速分化成小孢子叶,并于小孢子叶基部外侧形成乳突状花粉囊,其中充满体型大、细胞质浓的造胞组织。9月下旬至10月上中旬造胞组织进行有丝分裂,形成大量花粉母细胞。10月下旬,花粉母细胞减数分裂,进入四分体初期(图3 C),直到次年2月中、下旬均处于四分体时期(图3 D;图4),此时,花粉囊呈长椭圆形,绒毡层及1个小孢子叶的3～4个花粉囊清晰可见(图5)。次年3月底,四分体分离,形成单核花粉(图3 E、图3 F),4月上旬,小孢子叶球开放,二核花粉粒全部形成,此时花粉囊的绒毡层已被大部分吸收,只留下药室的外壁。

图3 小孢子发生

注:A为四面体形四分体。

注:A为着生于小孢子叶顶端的小孢子囊(个数不等,3～4个)。

2.3 小孢子的形态观察

从香榧小孢子的电镜扫描图像可以得出,成熟花粉单粒,近球形,直径为22～27 μm,褶皱成三歧状隆起,表面具有稀疏、大小不一的细瘤,无沟孔、无气囊(图6 Ⅰ～Ⅱ)。采集的同一地点不同单株类型小孢子在表观上无明显差异,表明一种植物花粉形态具有很强遗传保守性。

图6 小孢子的形态观察

显微结构:香榧成熟花粉呈椭圆形或圆形,有一个假萌发孔,显微镜下能看到两层壁,外壁厚,内壁薄(图6Ⅲ)。成熟花粉中含有少量淀粉,具二核(图6 ⅢA);败育花粉淀粉含量更多,花粉壁薄,仅具单核(图6 ⅢB)。

2.4 大孢子叶球的形态观察

如图7所示,大孢子叶球生长发育完成时,传粉滴出现,即雌球花发育成熟可以授粉。传粉滴膨大至饱满球形时为大孢子叶球的最佳授粉状态。若授粉时温度低于14 ℃,传粉滴会回缩,待授粉区域温度回升,传粉滴会再次吐露。

注:Ⅰ为3月22日生长状态;A为假种皮;B为珠被;C为珠心;Ⅱ为4月17日生长状态。

对贵州引种后的香榧雄球花(小孢子叶球)发育周期有了较清晰的认识,对雄花各个生长阶段的外部形态和显微结构有较准确的掌握:当年5月中下旬,一年生嫩枝上形成小孢子叶球原基,以造孢组织即鳞片紧紧包裹的形态越冬。在花芽发育过程中如遇不良气候条件,若越冬期间遭遇冻害等不良气候影响,则易导致花粉败育,败育花粉可达40%以上[6]。9—12月小孢子叶球生长旺盛期,小孢子叶球中轴迅速伸长,肉眼可见体积逐步增大,至翌年2月中下旬,小孢子母细胞开始分化,小孢子叶球从紧包的芽鳞中显现。3月中下旬至4月初,小孢子叶球成熟,体积变化不明显。结合小孢子叶球内外结构分析,仅通过外部形态观测即可了解香榧雄球花成熟时间[12]。

小孢子叶球生长、发育过程中,其外观颜色从嫩绿色变至黄褐色。4月上、中旬发育为成熟花粉粒,花粉粒无气囊,小孢子叶轴伸长、增粗,将成熟的小孢子囊推出,花粉成熟,小孢子叶球开始散粉。香榧雄球花整个生长、发育周期持续11个月左右。

通过对小孢子叶球外部形态与小孢子发育进程的对应关系展开研究,认为贵州引入地的香榧小孢子叶球原基早于原产地浙江等地出现。四分体多呈四面体结构。多年对香榧花粉采集时期的研究发现,花粉成熟后散粉时间很短,尤其是气温高、晴天会促进小孢子囊散粉。因此,花粉采集时间取决于小孢子叶球的颜色及开裂程度,天气好时应抓紧时间采收,以备人工授粉使用。

经过试验观测可知,香榧雄球花早雌花2～7 d开裂散粉,待到雌花进入最佳授粉的盛花状态时,雄球花已经进入末花期,花粉活性减弱、花粉量大大减少,从而降低授粉率。再者贵州省处于香榧产业发展初期,主要侧重产业的规模、香榧成年母树的产量以及栽种后所带来的综合效益,故香榧从业者在种植香榧时极易出现雄株少雌株多的局面,雌雄株配置比例不当,使得授粉用花粉数量远远不能自给。由此,需要人工干预辅助授粉,进而提高香榧授粉率和坐果率。

观测过程中发现,成熟花粉遇水或以水作为溶剂的液体,其内壁能迅速膨胀,在赤道区膨胀更显著,几秒钟内,外壁在中间一处破裂,并迅速脱离花粉。在脱离过程中,外壁收缩成突起,常被误认为是花粉发芽。下一步将对香榧有性生殖中雄配子体发育等展开研究。

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