杨叶肖槿内生真菌多样性和抑菌活性研究

宋静静,陆柳琳,黎俊杰,赵天义,彭春艳,曹宏明,邱清华,贾纪鑫,龚 斌

(1.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室,广西 钦州 535011;2.北部湾大学,广西 钦州 535011;3.钦州市农业技术推广中心,广西 钦州 535099)

【研究意义】红树林是一组生长在热带和亚热带潮间带河口地区的耐盐植物物种,具有独特的生态系统,可分为红树和半红树植物[1-2]。杨叶肖槿(Thespesiapopulnea)是锦葵科(Malvaceae)肖槿属(Thespesia)的一种半红树药用植物[3],具有抗菌[4]、抗氧化[5]、抗糖尿病[6]、抗高血脂[7]、抗肿瘤[8]、保护肝脏[9]等多种药理活性。内生真菌是植物微生态系统的重要组成部分,广泛存在于植物的健康组织中,能诱导植物系统抗性[10]。红树林内生真菌能够耐受多种胁迫,并通过产生大量具有特殊生物功能的代谢物而表现出较强的生物活性[11-12]。根据特殊生境植物生长特点分析其内生真菌的多样性,筛选出优势菌株和特有菌株,是挖掘具有生防作用及其他功能性作用菌株的基础。基于杨叶肖槿传统药用价值研究其内生真菌资源,并筛选出具有生物防治潜能的内生真菌,可丰富天然化合物及工程微生物资源,为现代农业高质量发展提供理论参考。【前人研究进展】研究表明,来自特殊生态位的内生真菌具有特定种类和功效,开发潜力巨大[13]。目前已从红茄苳(Rhizophoramucronata)[14]、海莲(Bruguierasexangula)[15]、木榄(B.gymnorhiza)[16]、红海兰(Rhizophorastylosa)[17]、秋茄(Kandeliacandel)[18]等红树植物中分离到多种具有抑菌活性的内生真菌。其中,红茄苳内生真菌对植物病原真菌腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)有较强的抑菌活性[19];海莲内生真菌对植物病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)均表现出较强的抗真菌活性[20];从木榄中分离出对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)具有抑菌活性的内生真菌[16];从红海榄中分离到对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌(Escherichiacoli)和白色念珠菌(Canidiaalbicans)有较强抑菌活性的内生真菌[17];从秋茄中分离获得对大肠杆菌和铜绿假单胞菌有抑菌活性的内生真菌[18]。在半红树植物中,从黄槿(Hibiscustiliaceus)中分离出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性的内生真菌[21];在阔苞菊(Plucheaindica)中分离获得对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)和醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)具有抗菌作用的内生真菌[22];从苦槛蓝中筛选到的内生真菌对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、炭疽菌(Colletotrichum)等植物病原真菌有明显的抑制作用[23-25]。杨叶肖槿是一种传统半红树药用植物,目前对其内生真菌及活性物质的研究非常有限。肖胜蓝等[26]从杨叶肖槿中筛选到8株内生真菌,其中1株对大肠杆菌表现出较强抑菌活性;林爱玉等[27]从杨叶肖槿中筛选到12株内生真菌,其中有2株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有较强的抑菌活性;Tang等[28]从杨叶肖槿中筛选到的内生真菌TM-Y1-1对香蕉炭疽病菌有抑制活性。【本研究切入点】前人对杨叶肖槿内生真菌的鉴定主要是依据形态学特征,采用分子生物学方法对杨叶肖槿内生真菌多样性进行的分类研究鲜见报道,且目前对杨叶肖槿内生真菌抑菌活性的报道不多,仅有少量研究表明其对大肠杆菌、金黄色葡萄球、白色念珠菌和香蕉炭疽病菌有抑菌活性,对其他病原菌的抑菌活性研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用形态学和分子生物学相结合的方法对杨叶肖槿内生真菌进行多样性分析,并用8种指示菌对其进行抑菌活性筛选,为红树林内生真菌抗菌药物的开发及其在农业病害防治上的应用提供参考依据。

1.1 样品采集和预处理

样品采自广西钦州市钦州港区仙岛公园(108°60′ E,21°76′ N)。采集杨叶肖槿植物的茎、叶和树皮组织,用自来水洗去表面的泥土和灰尘,然后在无菌操作台上进行表面消毒。首先将样品浸泡于75%酒精3～5 min,放进3%～5%次氯酸钠溶液30 s,再用无菌水冲洗干净,待洗净后在无菌操作台上放入干燥灭菌的培养皿中晾干备用。

1.2 培养基制备

PDA 培养基(真菌培养):去皮马铃薯200.0 g,加800 mL蒸馏水煮30 min,加葡萄糖20.0 g,氯霉素0.1 g,琼脂15.0 g,定容至1 L,调pH 至6.0。

LB培养基(细菌培养):称取蛋白胨10.0 g,酵母膏5.0 g,NaCl 10.0 g,蒸馏水定容至1 L,调pH 至7.0。

1.3 内生真菌培养及分离纯化

将处理过的茎、叶和树皮组织用无菌剪刀剪成5 mm×5 mm小块,各选出3个组织块印在PDA培养基上,作为阴性对照。然后将组织块分别贴于PDA培养基上,置于28 ℃的恒温培养箱倒置培养10～15 d,定期观察培养基生长情况,筛选生长良好的菌株。待植物组织的切口处有菌丝出现时,挑取生长良好菌丝的边缘部分,转接到纯化培养基上进行培养,经过多次分离纯化后得到的菌株接种于PDA斜面作为保种,4～8 ℃冰箱保存备用。

1.4 菌株鉴定

将菌株接种至PDA培养基上,置于28 ℃培养箱中培养。于菌株生长的最佳时期观察菌落颜色、大小、性状、生长情况、菌丝体、孢子的形态特征和表面特征,结合《真菌鉴定手册》[29]进行鉴定。

1.5 内生真菌DNA提取

将分离纯化得到的内生真菌接种到斜面PDA培养基上,活化后接种至液体PDA培养基中,置于28 ℃的摇床培养6～7 d,取出后装进离心管中,12 000 r/min离心5 min,取200 mg菌丝,用研磨棒研磨成匀浆状。根据真菌DNA提取试剂盒(Solarbio)参照说明提取杨叶肖槿的内生真菌DNA。

1.6 ITS rDNA序列分析

使用通用引物ITS1/ITS4(ITS1:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′; ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增真菌ITS rDNA序列[30]。PCR扩增反应体系:2×TaqMix 25.0 μL,DNA模板2.0 μL,ITS1/ITS4引物各1.0 μL,ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,进行30次循环;72 ℃延伸10 min。扩增完成后,每个样品取3 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。将正确扩增的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序得到的ITS rDNA序列通过NCBI数据库中BLASTN进行同源性检索,通过对比得出与其相似性最高的核酸序列,下载相似性较高的核酸序列,用MEGA 7.0软件构建系统发育进化树。

1.7 内生真菌多样性数据分析

通过分离率(Isolation frequency,IF)对杨叶肖槿组织样品中内生真菌的丰度进行分析,以Shannon-Wiener多样性指数(H′)和Margalef丰富度指数(R)进行多样性分析, 使用均匀度指数(E)对菌群分布的均匀程度进行分析。相关计算公式如下:

IF=内生真菌菌株数/菌株总数

H′ =-∑Pi×lnPi

R=(S-1)/Log2(N)

E=H′/ln(S)

式中,Pi为某种内生真菌菌株数占全部内生真菌菌株数的比例,S为样品中菌种总数,N为个体总数。

利用Excel 2021和IBM SPSS Statistics等软件对数据进行统计和分析。用单样本T检验(S)对杨叶肖槿不同部位的IF、H′、R和E进行分析。

1.8 内生真菌的抗菌活性筛选

1.8.1 内生真菌抗真菌活性筛选 选用从柿树、核桃、荔枝分离的炭疽菌(Colletotrichum)、香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型FOC1(Fusariumoxysporumf.sp.cubense1)和FOC4(Fusariumoxysporumf.sp.cubense4)、黄瓜瓜链格孢菌(Alternariacucumerina),以及白骨壤内生真菌链格孢菌(Alternariaalternata)作为指示菌,在35 ℃恒温箱中,用LB培养基通过平板对峙法[31]对内生真菌提取物进行抗真菌活性筛选。采用十字交叉法[32]测定指示菌单独培养的菌落半径(Rc)和对峙培养的趋向半径(Rp),计算抑菌率,得出内生真菌对指示菌的抑制效果。

抑菌率=(Rc-Rp)/Rc×100%

黄瓜瓜链格孢菌、白骨壤内生真菌链格孢菌由北部湾海洋微生物实验室分离保藏;柿树炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌和香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4由广西农业科学院植物保护研究所提供。

1.8.2 内生真菌抗细菌活性筛选 选用罗非鱼海豚链球菌(Streptococcusiniae)为指示菌,通过滤纸片法[33]对杨叶肖槿内生真菌提取物进行抗细菌活性筛选。先活化指示菌,采用接种针挑取单菌落接种至小瓶培养基中,置于摇床中培养1 d,用涂布器将细菌菌液均匀涂布于培养基上,再以直径6 mm的滤纸片蘸取内生真菌提取液贴在培养基上,用滤纸蘸取不含内生真菌提取物的乙酸乙酯溶液为阴性对照,培养并观察抑菌情况,后续测量抑菌圈大小,记录试验数据。海豚链球菌由北部湾海洋微生物实验室分离保藏。

2.1 杨叶肖槿内生真菌的分离情况

从杨叶肖槿的茎、叶、树皮组织中共分离纯化获得60株内生真菌,结合《真菌鉴定手册》[30]进行形态学鉴定,分属于5个属。杨叶肖槿部分内生真菌菌落见图1。其中,杨叶肖槿树皮组织分离到的菌株最多,共分离到4个属23株真菌,占总分离量的38.33%;其次为叶片组织,共分离到4个属19株真菌,占总分离量的31.67%;从杨叶肖槿的茎组织分离到4个属共18株真菌,占总分离量的30.00%(表1)。

表1 杨叶肖槿不同组织中内生真菌属的组成Table 1 Composition of endophytic fungi genus in different tissues of T.populnea

图1 杨叶肖槿部分内生真菌菌落特征Fig.1 Characteristics of partial endophytic fungal colonies of T.populnea

2.2 杨叶肖槿内生真菌的分子生物学鉴定

通过BLASTN对分离到的60株内生真菌的ITS rDNA序列进行分析。结果表明,60株内生真菌都属于子囊菌门的盘菌亚门,涵盖4个目5个属。其中,Y1-11菌株与已知真菌ITS rDNA参考序列的相似性只有87.68%;Y1-39、Y1-50、Y2-58菌株与已知真菌ITS rDNA参考序列的相似性均低于90.00%;J2-30、Y3-37、Y1-47、Y3-53、P2-24、P2-25、P3-33、P3-44与已知真菌ITS rDNA参考序列的相似性均低于95.00%,可能是潜在新种;其余内生真菌菌株与已知真菌ITS rDNA参考序列的相似性均在95.00%以上,最高为99.96%,多样性较丰富(表2)。

表2 杨叶肖槿内生真菌ITS rDNA序列的BLASTN分析Table 2 BLASTN analysis of ITS rDNA sequence of endophytic fungi in T.populnea

用MEGA7.0软件构建系统发育进化树(图2),结果表明这60株真菌聚类为5个分支。P2-26、P2-25、J2-19、P2-24、P1-28、P1-60、P1-14、P3-1、P1-7、J1-20、J2-56、J2-6、P1-43、P1-10、P2-55、P2-36、P2-5、P2-31、P1-46、P1-51、P2-4、Y3-35、Y3-49、Y3-52、Y2-61、Y3-15、Y2-42、P2-40、Y3-48这29株菌株属于炭疽菌属,与C.tropicale、C.aeschynomenes、C.fructicola、C.queenslandicum、C.aotearoa等菌株构成一个支持率为99%的分支;J2-29和J2-30菌株属于小隐孢壳属,与C.amistadensis菌株构成一个支持率为99%的分支;Y3-53、Y3-37、J1-45、J2-2、J2-18、J2-32、J2-57、P1-27、P1-34、J2-12、J1-16、J2-17、J1-38、P2-13、Y2-62、Y2-3这16株菌株属于间座壳属,与D.pseudomangiferae、D.arengae、D.limonicola、D.oculi等菌株构成一个支持率为95%的分支;P3-54、Y3-59、Y3-22、Y3-23这4株菌株属于亚隔孢壳属,与参考菌株D.keratinophila、D.prosopidis构成一个支持率为100%的分支;P3-33、P3-44、J1-9、J3-41、Y1-11、Y1-47、Y2-58、Y1-39、Y1-50这9株菌株属于葡萄座腔霉属,与B.agaves、B.fabicerciana、B.fusispora等菌株构成一个支持率为98%的分支。

图2 基于杨叶肖槿内生真菌ITS rDNA序列构建的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of endophytic fungi in T.populnea

2.3 杨叶肖槿内生真菌的多样性

分离纯化获得的60株内生真菌分属于5个属25个种,其中炭疽菌属(Colletotrichum)和间座壳属(Diaporthe)是优势菌属,分别包含29和16株真菌,分离率为48.33%和26.67%;葡萄座腔霉属(Botryosphaeria)含有9株真菌,分离率为15.00%;亚隔孢壳属(Didymella)和小隐孢壳属(Cryptosporella)分别含有4和2株真菌,分离率为6.70%和3.33%。茎组织分离到的内生真菌包括葡萄座腔霉属、炭疽菌属、小隐孢壳属和间座壳属,小隐孢壳属只在茎组织中分离到,在叶和树皮中未分离到。叶片组织分离到的有炭疽菌属、亚隔孢壳属、间座壳属和葡萄座腔霉属内生真菌。树皮组织共分离纯化出23株菌株,其中17株为炭疽菌属,亚隔孢壳属、间座壳属和葡萄座腔霉属也有少量分布,分别为1、3和2株(表3)。

表3 杨叶肖槿内生真菌在各组织的分布情况Table 3 Distribution of endophytic fungi in various tissues of T.populnea

杨叶肖槿茎、叶、树皮组织分离的内生真菌H′分别为2.11、2.32和2.34,其中树皮组织内生真菌的多样性最高,但三者之间无显著差异(P>0.05,下同);R分别为2.20、2.54和2.87,R的变化规律与H′类似,树皮组织分离内生真菌R也高于茎和叶,且三者之间不存在显著差异。杨叶肖槿茎、叶和树皮组织分离内生真菌之间的E则存在显著差异(P<0.05,下同),其中叶组织分离内生真菌E最高(0.94),其次为茎组织(0.92),树皮组织最低(0.89)(表4)。

表4 杨叶肖槿不同组织中的内生真菌多样性Table 4 Diversity of endophytic fungi in various tissues of T.populnea

2.4 杨叶肖槿内生真菌的抗真菌和抗细菌活性

选用柿树炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4、黄瓜瓜链格孢菌、白骨壤内生真菌链格孢菌、海豚链球菌做为指示菌,对分离得到的60种杨叶肖槿内生真菌进行抗真菌和抗细菌活性筛选。结果显示,共有9株内生真菌对指示菌显示出抑菌活性,其中炭疽菌J1-20(C.arecicola)对8种指示菌均表现出较强的抑菌活性。J1-20菌株对6种植物病原菌的抑菌率分别是39.39%、25.00%、19.10%、32.43%、28.20%和89.00%,对白骨壤内生真菌链格孢菌的抑菌率为74.19%(表5),同时对海豚链球菌抑菌圈大小为21 mm,说明J1-20菌株具有广谱抑菌活性(图3),有较好的开发潜力。其他菌株中,Y1-11菌株对白骨壤内生链格孢菌的抑菌率较强,达80.64%,但对其他真菌和细菌抑菌活性都较弱。统计分析显示,除J1-20菌株对核桃炭疽菌的抑菌率极显著低于J2-30(P<0.01,下同),对香蕉枯萎病菌FOC1的抑菌率极显著低于P2-24菌株外,J1-20菌株对柿树炭疽菌、荔枝炭疽菌(P1-46菌株除外)、香蕉枯萎病菌FOC4、黄瓜链格孢菌、白骨壤内生链格孢菌(Y1-11菌株除外)、海豚链球菌6种病原菌的抑菌率均极显著高于其他菌株。

表5 杨叶肖槿内生真菌的抗真菌和细菌活性 Table 5 The antifungal and antibacterial activities of endophytic fungi from T.populnea

A:柿树炭疽菌;B:核桃炭疽菌;C:荔枝炭疽菌;D:香蕉枯萎病菌(FOC1);E:香蕉枯萎病菌(FOC4);F:黄瓜瓜链格孢菌;G:白骨壤内生真菌链格孢菌;H:海豚链球菌。A:Colletotrichum of D.kaki; B: Colletotrichum of J.regia; C:Colletotrichum of L.chinensis; D:F.oxysporum f.sp.cubense 1; E:F.oxysporum f.sp.cubense 4; F:A.cucumerina; G:A.alternata; H:S.iniae.图3 J1-20菌株的抗真菌和抗细菌活性Fig.3 Antifungal and antibacterial activities of strain J1-20

本研究从半红树药用植物杨叶肖槿中分离到60株内生真菌,利用形态学和分子生物学相结合的方法进行分类鉴定,分属于5个属25个种。其中有12株内生真菌与NCBI数据库中已知ITS rDNA序列相似性低于95.00%,可能是潜在新种,有待进一步研究。杨叶肖槿的内生真菌多样性丰富,以炭疽菌属和间座壳属为优势种群,其次为葡萄座腔霉属、亚隔孢壳属和小隐孢壳属。肖胜蓝等[26]从杨叶肖槿分离到8株内生真菌,但因其不产孢,尚未明确株菌的分类;林爱玉等[27]在杨叶肖槿中分离到5株内生真菌,分属于镰孢属和青霉属。以上2位学者均仅是通过形态学特征对杨叶肖槿内生真菌进行鉴别,可能是因为镰孢属和青霉属真菌易产孢,较易通过形态学观察进行鉴别,而其他内生真菌不容易产孢,单纯依据形态学的鉴定方法较难对其进行准确分类。本研究首次准确地鉴定出药用半红树植物杨叶肖槿内生真菌的类型及其在不同组织的分布状况等,为杨叶肖槿内生真菌多样性的研究提供了参考数据。

抗真菌活性结果显示,J1-20菌株对柿树炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4、黄瓜瓜链格孢菌、白骨壤内生真菌链格孢菌和海豚链球菌均表现出较强的抑菌活性。J1-20菌株属于炭疽菌属真菌。尽管炭疽菌属的许多病原菌都是植物病原体,但C.arecicola能产生多种具有不同生物活性的次生代谢物。至今,已经报道了至少109种炭疽菌的次生代谢物,主要包括含氮代谢物、固醇、萜烯、吡酮、酚类和脂肪酸等[34]。C.arecicola是胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的一个复合种[35],主要分布在澳大利亚、印度、新西兰和中国台湾,在全缘佛塔树(Banksiamarginata)和新西兰牡荆(Vitexlucens)等植物上引起过炭疽病[36-38],但C.arecicola作为植物内生真菌的有关研究较少。Hsiao等[39]从金石榴(Brediaoldhamii)的叶片中分离到C.arecicola的一个内生真菌菌株(BCRC 09F0161),该菌株产生18种次生代谢物,均能抑制活化巨噬细胞活性氧自由基(NO)的产生,且无细胞毒性,但针对这些次级代谢产物的抑菌活性研究还较少。目前已从胶孢炭疽菌中分离到一些具有较强抗真菌和抗细菌活性的次生代谢产物[40-41],推测J1-20菌株中应该也含有一些抑菌效果较好的化合物,可作为新的生物农药来源进行深入研究开发。

本研究中,仅在杨叶肖槿的树皮组织中分离到J1-20菌株,在茎段和叶片中并未分离到J1-20菌株。杨叶肖槿树皮中的生物活性物质可治疗痢疾、痔疮及各种皮肤病[7, 42],表明杨叶肖槿内生真菌的活性可能与宿主植物的药理活性有关,从植物的药用部位分离内生真菌获得含有相似药理活性菌株的可能性更大[43]。杨叶肖槿的树皮内含有生物碱、聚酮、萜类、甾醇类、蒽醌类等多种活性成分,且显示出良好的抗菌作用[7, 44]。本研究中分离到的J1-20菌株也来自树皮,故推测J1-20菌株也可能含有类似的次生代谢产物。下一步将对J1-20菌株的活性成分进行分离鉴定,并对其抗菌机制进行研究,有望开发出新的生态友好型抗菌药物。

本研究从半红树药用植物杨叶肖槿中共分离到60株内生真菌,分属于5个属25个种,以炭疽属和间座壳属为主。分离的内生真菌多样性丰富,且在各组织中分布均匀。J1-20菌株对柿树炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4、黄瓜瓜链格孢菌、白骨壤内生真菌链格孢菌和海豚链球菌有抗菌作用,有进一步开发利用的潜力。

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