腐乳混合发酵剂配方优化

杨润，任淑娣，陈中爱，刘丽静，许家威，胡永金

云南农业大学食品科学技术学院（昆明 650201）

腐乳是我国一种具有悠长历史的大豆蛋白发酵食品。其具有风味独特、营养丰富、易保存的特点[1-2]，在中国及东南亚地区深受人们喜爱[3]，常作为佐餐食品呈现于人们餐桌[4]，因其制作方法和质地口感类似奶酪，在欧美，许多人把它称作中国干酪[5]。腐乳中不仅包含了大豆自身的各种活性物质，还经过微生物发酵作用去除了大豆苦腥味、胀气因子和抗营养因子，生产出各种有香气的有机酸、醇类、酯类和氨基酸[6]，以及硫胺素、尼克酸、钙和磷等营养成分[7]，具有降血压、降低血液中的胆固醇[8-10]、抗氧化[11]及保护人体神经系统[12-13]等功能。另外，在腐乳加工过程中还会产生人体必需的VB12[14]。腐乳发酵过程涉及多种微生物，其主要制曲菌种为雅致放射毛霉、总状毛霉、五通桥毛霉及高大毛霉[15]。毛霉能分泌多种酶，将大豆中的蛋白质、脂质和碳水化合物水解成氨基酸和小分子，对品质形成有重要贡献，是主要的腐乳发酵菌种[16]。

传统发酵腐乳生产是一种开放式的过程，未经过加热杀菌，因此存在被环境微生物（例如蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等）[17]和其他杂菌污染的风险。另外，腐乳产品中还含有较多的蛋白质及氨基酸，这些物质容易使细菌产生耐药性并对人体健康造成威胁。目前我国腐乳产业生产主要是利用单一菌种发酵，但采用单一菌种或自然发酵，存在酶系不全、腐乳风味单调等问题[18-19]。基于上述原因，此研究从风味良好的自然发酵腐乳中筛选出蛋白酶活力较强的菌种进行混菌发酵并研制发酵剂，既能保留其固有风味，又能使产品发酵更为稳定，是一种传统发酵产品升级的有效途径[20]，为广大消费者消除食品安全问题的同时为该产业大规模生产提供技术支持和品质保障。

1.1 材料与试剂

新鲜豆腐、豆腐干粉（新鲜豆腐烘干打碎，市售）；
毛霉M-T、毛霉40899、M-7、M-H和M-R（实验室分离）；
干酪素、碳酸氢二钾、碳酸二氢钾、三氯乙酸、碳酸钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

H2-16KR高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；
SHA-BA恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）；
LDZX-5OKBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安有限公司）；
SW-CJ-2D双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；
BSC-250恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；
HWS24恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；
PHS-3CPH计（仪电科学仪器有限公司）；
热板IT-09A5磁力搅拌器（上海一恒科学仪器有限公司）；
EX30光学显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）。

1.3 测定方法

1.3.1 微生物的测定

菌落总数测定参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[21]进行测定。

1.3.2 理化指标的测定

水分含量测定参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[22]直接干燥法进行测定；
总酸测定参照GB 12456—2021《食品中总酸度测定》[23]pH计电位滴定法进行测定；
氨基酸态氮含量测定参照GB 5009.235—2016《氨基酸态氮测定》[24]酸度计法进行测定。

1.4 蛋白酶活力的测定

蛋白酶活力的测定参考潘进权[25]的方法。

1.5 发酵剂制作工艺

配制培养料→灭菌→接种菌种→培养→干制→粉碎→检验→成品

培养料：25 g豆腐干粉和水混合，置于150 mL三角瓶中。

水分pH：用乳酸调节pH至指定值。

灭菌：121 ℃下灭菌20 min，趁热摇散。

接种菌种：接入1×106CFU/g的菌悬液。

培养：于28 ℃培养72 h。

干制：培养完后于50 ℃烘制18 h。

检验：检测发酵剂中霉菌的含量。

1.6 单因素试验设计

试验选择水分添加量（90%，100%，110%，120%和130%）、水分pH（pH 2.5，3，3.5，4和4.5）、菌液添加量（2%，3%，4%，5%和6%）以及菌种比例（3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）按照工艺流程进行单因素试验，以发酵剂的霉菌总数为指标对工艺进行分析。

1.7 响应面试验设计

通过单因素试验，选出影响腐乳发酵剂霉菌量最大的三个因素，基于此，采用Box-Behnken设计，并以霉菌数量作为反应指标，详见表1。

表1 响应面试验参数的因素与编码水平

1.8 发酵剂发酵特性检测

针对响应面优化后得出的结果，进行腐乳发酵实验，检测发酵剂发酵腐乳的性能，对接种发酵剂后72 h内（每隔12 h）蛋白酶活力、毛坯的总酸以及氨基酸态氮进行测定。

1.9 数据分析统计方法

运用IBM SPSS Statistics 19进行差异性显著分析，并采用Origin Pro 2018软件来绘制相关图表。

2.1 发酵菌种的选择

在腐乳发酵过程中，童佳[26]认为蛋白酶是酱油风味形成的关键酶，它将大豆中的蛋白质降解为氨基酸、多肽[27]等，对风味及滋味有重要作用。陈怡等[28]将蛋白酶活力作为选择浏阳豆豉发酵菌株的重要指标。选择蛋白酶活力高的菌株，对提高发酵豆制品风味有重要意义。通过对实验室现有的5株腐乳发酵用霉菌进行蛋白酶活力比较，结果如表2所示。M-T和M-40899在72 h内蛋白酶活力最高，因此选定M-T和M-40899为发酵剂的菌株。通过对发酵剂水分添加量、pH、菌液接种量以及菌种的比例来优化发酵剂的配方。

表2 菌种蛋白酶活力的比较 单位：μg/mL

表3 发酵剂条件响应面设计结果

2.2 腐乳发酵剂影响因素研究

2.2.1 水分添加量对发酵剂霉菌数的影响

水分添加量对腐乳发酵剂霉菌数的影响见图1。由图1可知，随着水分添加量的增加，霉菌数先增加后下降。由于水分含量的增长，腐乳湿度增大，霉菌的生长条件受到一定的影响，水分含量过大则会使其生长速度也受到限制，导致菌落计数随水分的增加而逐渐减少[29]。水分添加量在110%时霉菌数最高，为8.26 lg CFU/g。这是由于霉菌的生长需要适宜的水分，而110%的添加量使得发酵剂初期的含水量在70%左右，满足霉菌的生长需求，所以水分添加量选择110%。

2.2.2 pH对发酵剂霉菌数的影响

pH的变化对腐乳发酵剂霉菌数的影响见图2。由图2可知，腐乳发酵剂霉菌数随着水分pH的增加呈现出先上升后下降的趋势，在pH为3.5时霉菌生长最旺盛，数量达到最高，为8.31 lg CFU/g。微生物的繁衍需要适宜的pH范围，而大多数在7.0左右，但霉菌的范围比较广，在酸性条件下也能生存，还能抑制其他杂菌的生长[30]，同时由于传统腐乳发酵前期pH偏向于酸性，因此用乳酸把发酵剂所添加的水分pH分别调成2.5，3.0，3.5，4.0以及4.5，探究不同pH下霉菌的生长情况。

图2 pH对发酵剂霉菌数的影响

2.2.3 菌种比例对发酵剂霉菌数的影响

菌种比例的变化对腐乳发酵剂霉菌数的影响见图3。由图3可知，M-T毛霉和40899霉菌的比例影响着发酵剂的霉菌数。当霉菌40899添加量不变时，霉菌数随着毛霉M-T数量的减少呈先增加后减少的趋势；
当毛霉M-T添加量不变时，霉菌数随着毛霉40899数量的增加而减少。当菌种比例为2∶1时，霉菌数最高，为8.27 log CFU/g。不同的霉菌发酵腐乳都会造成产品的风味和可接受度方面的差异[31]，且单一菌种发酵腐乳会因为酶系单一的原因导致风味口感不佳，所以借助双菌种来发酵腐乳能对腐乳风味以及品质有一个提升。

图3 菌种比例对发酵剂霉菌数的影响

2.2.4 菌种添加量对发酵剂霉菌数的影响

菌种添加量的变化对腐乳发酵剂霉菌数的影响见图4。由图4可知，随着菌液的添加量的增加，霉菌数呈现先上升后下降的趋势，但总体变化不大，菌液添加量为4%时霉菌数最高，为8.26 log CFU/g。

图4 菌液添加量对发酵剂霉菌数的影响

2.2.5 响应面因素及水平的确定

由图5可知，菌液添加量的变化对于发酵剂的霉菌数的影响小于水分添加量、pH和菌种比例，且发酵剂霉菌数随菌液添加量的变化波动不大，因此以质量的4%确定添加量。同时以水分添加量、pH和菌液比例三个因素的三个水平设计响应面试验。

图5 单因素的组间标准差比较

2.3 发酵剂配方的响应面优化

利用Design-Erpert 8.0软件对数据进行拟合分析，以霉菌数为因变量，以水分添加量（A）、pH（B）和菌种比例（C）为自变量得到的回归方程为霉菌总数=8.27+0.025A-0.05B-0.13C+0.025AB-5.0×103AC+0.06BC-0.071A2-0.081B2-0.11C2。

回归方程分析结果见表4。

表4 发酵剂回归模型方差分析表

由表4的方差分析数据可知，应用Design-Expert 8.0软件得到的数据模型是极显著的（P＜0.000 1＜0.01），而失拟项不显著（P=0.084 8＞0.05），这说明此试验得到的数据模型的回归方程拟合度良好，试验结果可靠。

2.4 响应面结果分析

利用Design-Expert 8.0软件绘制能反映影响发酵剂霉菌数的3个因素交互作用的三维响应面图，如图6至图8所示。菌种比例和pH对发酵剂霉菌数有显著影响，而水分添加量和pH与水分添加量和菌种比例对于发酵剂的霉菌数的影响不显著。每个因素各自的交互作用十分显著，表明各因素作为试验控制具有显著意义，各个因素显著程度依次为菌液比例＞pH＞水分添加量。利用Design-Expert 8.0软件优化分析，确定最佳提取工艺：水分添加量为111%，pH为3.22，菌液比例为0.69，预测值为8.34 lg（CFU/g）。通过验证试验，发酵剂成品霉菌数为8.35 lg（CFU/g）。

图6 水分添加量与pH对霉菌总数影响的响应面及等高线图

图7 水分添加量与菌种比例对霉菌总数影响的响应面及等高线图

图8 pH与菌种比例对霉菌总数影响的响应面及等高线图

2.5 发酵剂发酵腐乳性能的探究

根据响应面结果分析优化之后发酵剂的配方按照发酵剂制作工艺步骤制备腐乳双菌种发酵剂，并用得到的发酵剂发酵腐乳，发酵情况如图9所示，同时测定发酵72 h内蛋白酶活力、总酸以及氨基酸态氮的变化，以检测发酵剂的发酵性能。

图9 发酵剂发酵腐乳的毛霉生长情况

2.6 蛋白酶活力、总酸及氨基酸态氮随时间的变化

通过测定腐乳发酵过程中的蛋白酶活力，可以反映腐乳的发酵状态[32]。酶活力越旺盛，则腐乳的蛋白质降解得就越快。如图10所示，发酵剂培养的毛坯在72 h时蛋白酶活力能达到37.25 μg/g。

图10 蛋白酶活力、总酸及氨基酸态氮随时间的变化

腐乳在发酵过程中会产生有机酸、游离脂肪酸、游离氨基酸等物质，是腐乳酸度形成的主要因素[33]。由图10可知，在腐乳发酵剂下，总酸在72 h发酵过程中处于上升状态。在前发酵过程中，总酸的来源是乳酸菌代谢生产乳酸、醋酸、琥珀酸等有机酸[34]，对总酸的形成起着非常大的作用。与传统腐乳前发酵时期的总酸含量对比，发酵剂发酵的腐乳总酸含量上升得稍快，是因为发酵剂含有两种毛霉，复合发酵使得酶活力更高、所引起的大分子物质降解更快、更多。

氨基酸态氮是腐乳发酵的判断指标。由图10可知，发酵剂发酵腐乳的游离氨基酸态氮含量也上升明显，蛋白质在酶作用下不断地降解产生氨基酸，导致氨基酸态氮含量小幅增长，含量由0 h的0.004 g/100 g上升到72 h的0.056 g/100 g。与牟定腐乳不同的是，市售腐乳初始蛋白酶活力略低，但是同时间段上升的幅度远大于牟定腐乳，而游离氨基酸态氮又被誉为判断腐乳成熟的指标之一，因此可以说明发酵剂的发酵性能优良。

通过响应面优化，得到腐乳发酵剂工艺优化结果，即水分添加量为培养基质的111%，pH为3.22，菌液比例为0.69。此时发酵剂的霉菌数为8.35 lg CFU/g。使用发酵剂发酵腐乳的总酸、氨基酸态氮以及蛋白酶活力变化分别从0 h的0.018 g/100 g，0.004 g/100 g和9.12 μg/mL上升到72 h时的0.142 g/100 g，0.056 g/100 g和37.25 μg/mL，与传统自然发酵的腐乳同时期总酸和氨基酸含量变化增速更快，说明发酵剂发酵性能好。

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