濒危植物紫纹兜兰无菌萌发研究

谭 勇, 林春惠, 潘发光, 陈国华, 胡群英, 易绮斐

(1.中国科学院华南植物园,广东省应用植物学重点实验室, 广州 510650;2.仲恺农业工程学院农业与生物学院, 广州 510225)

紫纹兜兰(PaphiopedilumpurpuratumLindl. Stein)隶属于兰科(Orchidaceae)兜兰属(Paphiopedilum),主要分布于广东、广西、香港以及云南等省区,是国家一级重点保护野生植物[1]。兜兰有分株繁殖和种子繁殖两种方式,分株繁殖的周期长,繁殖系数低;而种子繁殖对环境的依赖性强,需要共生真菌入侵才萌发,且自然状态下萌发率极低[2],兜兰繁殖特点导致野外种群狭窄,个体数量有限。由于兜兰生存环境的恶化及其野生资源的过度采挖,兜兰已成为最濒危的植物物种之一[3-4]。

通过无菌萌发可以获得兜兰属的试管苗,无菌萌发成了繁殖兜兰最有效的方法[5-6],但原生种兜兰的无性克隆极其困难,主要表现在外植体消毒困难且易受污染、生长时间长、褐变严重,物种间存在较大差异,同一培养条件对兜兰属内各种没有适用性[7]。大部分兜兰属的无菌繁殖技术还不成熟[8],兜兰属的许多原生种还未找到有效的无菌萌发培养基环境,不利于兜兰属的资源保育和产业发展,其中包括紫纹兜兰。本研究以紫纹兜兰的种子作为外植体,探索适合种子萌发和诱导原球茎成苗的培养基配方,建立紫纹兜兰的快速繁殖方式,为紫纹兜兰的保育研究提供一定的基础。

1.1 实验材料

采集广东省河源市紫金白溪省级自然保护区中野外自然状态授粉210 d结实的紫纹兜兰蒴果作为实验材料。

1.2 实验方法

1.2.1果荚消毒处理及电镜扫描

采集授粉210 d的绿色果荚,用自来水清洗果荚表面,在超净工作台上用75%的酒精棉球擦拭5～10 min,再用0.13%的氯化汞浸泡15 min,取出用无菌水冲洗3次,最后用无菌滤纸擦干果荚,即完成消毒。随后用手术刀切开果荚取出种子,用于培养基接种和体视镜下观察种子形态。

将种子放于离心管中,加入2 mL的无水乙醇,放入超声波清洗机5 min,随后室温干燥,将干燥后的种子贴在双面碳胶带样品台上,用LEICA EM ACE600离子溅射仪镀铂金(厚度10 nm),电流20 mA,在JSM-6360LV高低真空扫描电子显微镜下观察种子形态特征。

1.2.2紫纹兜兰种子萌发培养基的筛选

以MS、1/2 MS、1/4 MS、花宝一号为基础培养基,分别添加100 mL/L椰汁、20 g/L蔗糖、7 g/L琼脂粉,pH值调至6.0,配置4组无菌萌发培养基,分别编号为A、B、C、D,用于探讨紫纹兜兰种子萌发的最适基础培养基。

以1/4 MS+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉为基础培〗养基,分别添加100 mg/L香蕉泥、100 mg/L土豆泥、100 mg/L苹果泥,pH值调至6.0,配置3组无菌萌发培养基,分别编号为E、F、G,与C培养基组成对照组,用于探讨不同有机添加物对紫纹兜兰种子无菌萌发的影响。

以1/4 MS+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉为基础培养基,添加0.3 ml/L 6-苄氨基嘌呤、0.1 mL/L 1-萘乙酸,再分别添加100 mL/L椰汁、100 mg/L香蕉泥,pH=6.0,配置2组无菌萌发培养基,分别编号为H、I,与C、E培养基组成对照组,用于探讨不同有机添加物和植物调节剂对原球茎生长的影响。

每组培养基配制1 L,分装成28瓶后进行灭菌,冷却后备用,将消毒后的种子播种于培养基中,置于光照强度1 600 lx,温度25 ℃的条件下,保证9.5 h/d的光照时间,90 d后观察并统计种子萌发数,计算萌发率,记录原球茎的生长情况。

图1 紫纹兜兰果荚

1.2.3紫纹兜兰生根壮苗培养

为避免生长环境改变引起的褐化,当紫纹兜兰小苗分化生长出2～3片叶子、叶长1～1.5 cm时,将其以根部朝下放置的方式转移到配方与H、I完全一致的培养基中继续培养,培养条件为温度25 ℃,光照时间9.5 h/d。观察并记录生根壮苗的情况,如根系、叶片长度以及整株长势。根据组培苗生长的实际情况出瓶栽培。

1.2.4紫纹兜兰试管苗炼苗移栽

将30株试管苗移至培养室外放置7 d,而后打开培养瓶的盖子,继续放置7 d,完成炼苗。移栽时用清水洗去小苗根部的培养基,经0.1%的多菌灵溶液浸泡幼苗5 min后用清水冲洗干净,晾干后移入腐殖土和松树皮配比1∶1(体积比)的栽培基质中。

注:a为体视镜下的种子形态;b为电镜扫描下的有胚种子;c为电镜扫描下的无胚种子。

1.2.5数据统计与分析

实验数据采用Excel2007软件进行统计分析。统计种子培养至出现白色或淡绿色原球茎的种子数,计算90 d的萌发率;观察记录种子分化成带有2～3片叶片的原球茎,在上述条件下培养90～100 d后的成苗情况。

2.1 种子表面形态特征观察

紫纹兜兰种子细长,种皮细胞接近长方形,长135 μm,宽40 μm左右,木质素类物质的表皮细胞排列整齐,种子无胚乳,且仅有少部分种子胚发育完整,具有萌发潜力。电镜下观察到种皮表面皱缩,与体视镜下观察有一定出入,可能是浸种吸水导致种子膨大。在电镜扫描下能发现两种形态的种子,两端封闭和一端有孔口两种类型。

2.2 不同基础培养基对紫纹兜兰种子萌发的影响

由表1可见,不同类型的基础培养基对种子萌发的影响差异较大,MS培养基的萌发率最低,为6.85%,其次是1/2 MS,萌发率为14.50%,1/4 MS的萌发率最高,为56.60%,表明紫纹兜兰种子在无机盐浓度较低的情况下更容易萌发。基础培养基为花宝一号的萌发率为22.22%,萌发时间比MS系列培养基长,少量原球茎出现褐化现象。

表1 不同培养基下种子的萌发率

2.3 有机物对紫纹兜兰种子萌发的影响

紫纹兜兰种子在添加土豆泥(F培养基)和苹果泥(G培养基)的培养基上基本不萌发,添加香蕉汁的E培养基萌发率为37.14%。添加了椰汁(C培养基)和香蕉汁(E培养基)的萌发情况如图3所示,两种有机添加物明显促进了种子的萌发,添加椰汁的种子萌发时间比添加香蕉泥的萌发时间提前15 d左右,并且在添加椰汁的情况下,原球茎生长得更大。

图3 不同有机物对种子萌发的影响

2.4 生长调节剂对紫纹兜兰种子萌发的影响

H、I培养基的萌发率分别为78.13%和58.55%(表1),比未添加植物激素的E、C对照组培养基的萌发率分别提高了21.51%和21.41%,添加植物激素后,原球茎的生长速度、转绿速度及直径大小明显提升。种子及原球茎的生长情况如图4所示,在激素条件相同的情况下,椰汁和香蕉泥对原球茎的影响存在明显的差异,H培养基显著提高了原球茎的生长速度及大小,前期分化慢,分化后生长速度快。I培养基的原球茎为H培养基的1/4大小时即出现叶芽分化,且发生了明显的增殖,但生长缓慢。

2.5 不同培养基对紫纹兜兰生根壮苗培养和移栽的影响

当紫纹兜兰原球茎分化出少量根和叶时,转入生根壮苗培养基中继续培养,幼苗生长状况如图5所示。培养初期,H培养基中幼苗只生长不增殖,幼苗根系粗壮,生长速度明显高于I培养基,而I培养基中依然有叶芽分化。培养后期,H培养基中幼苗叶片大而肥厚,根系发达,可进行移栽,移栽时抓土性强,叶片肥厚,植株适应性强,成活率100%;此时I培养基中幼苗的数量为H培养基中的3～4倍,长势明显落后,叶片瘦小,根系细短,

图5 不同培养基对生根壮苗的影响

种子作为组织培养的外植体,其生物学特性直接影响萌发率。有研究表明,成熟的兜兰种子在培养基中难萌发,可能是形成了不可渗透的木质素种皮,阻碍了水分和营养物质的吸收[9];幼嫩的种子萌发率也低,因为此时种胚还未发育完全,需要先合成营养物和形成器官[10];发育到一定阶段的未成熟种子萌发率较高[11]。不同种类的兜兰种子最适宜萌发期也有所不同,古德兜兰、菲律宾兜兰的最佳萌发期是授粉90 d后[12];授粉后180 d的彩云兜兰萌发最佳[13]。本实验中所用的果荚较绿,部分种子的胚尚未完全发育,是影响萌发率的原因之一;种皮皱缩,木质素类物质积累导致种皮透水性下降,与本实验电镜观察下的种胚多数发育不良,也是导致本实验萌发率降低的原因[14];部分种子的一端有孔口,可能在种子萌发过程中起吸收作用或者在自然条件下,种子共生萌发时菌丝从该孔口进入种子接触种胚[15]。

兜兰作为兰科植物中无菌萌发机制最复杂的种类,在非共生萌发的过程中,产生影响的外在因素包括培养基成分、培养方式及培养环境等[4]。培养基成分的确定也是众多因素中最关键和最复杂的,因此需要从多个方面来探讨不同培养基对种子萌发的影响。MS系列培养基的培养结果表明,紫纹兜兰对无机盐浓度敏感,无机盐浓度越低越有利于紫纹兜兰种子萌发,1/4 MS为最适合紫纹兜兰种子萌发的基础培养基,与海南蝴蝶兰[16]的基础培养基一致,大多数兜兰的萌发研究也表明,高盐浓度的MS培养基会抑制种子萌发[17],但低盐浓度MS培养基容易导致原球茎生长所需的营养成分不足[5],加入有机添加物可在一定程度上解决该问题。

在培养基内加入营养有机物,对种子萌发、外植体分化、增殖有明显的促进作用[18]。椰汁和香蕉汁是复杂的营养混合物,含有糖分、蛋白质、酶和作用机制不明的有机物等,能为植物的生长提供生理活性物质和一些未知的微量成分[19]。在本实验中,椰汁对紫纹兜兰原球茎及幼苗的生长有明显的促进作用,很有可能是因为椰子汁本身含有一定的生长激素以及一些其他的活性组分,使植物的成熟细胞快速分裂[20]。而添加香蕉汁能促进紫纹兜兰原球茎提前分化,增加叶芽数量。香蕉汁是广泛使用的有机添加物,能促进外植体增殖分化和维持培养基的pH值,使原球茎在适宜的酸性条件下生长[21]。但生根壮苗的培养结果显示,添加香蕉汁的培养基中紫纹兜兰幼苗的根和叶均生长缓慢,这与何松林等[22]对培养蝴蝶兰幼苗的研究结果一致。综合本实验,含有椰子汁成分的培养基比含有香蕉汁的培养基种子萌发率更高,说明椰子汁中的营养物质和生理活性物质的配比更适合紫纹兜兰的种子萌发和原球茎的生长,繁殖周期更短;而添加香蕉汁对原球茎有明显的增殖作用;苹果泥和土豆泥等有机添加物也常用于植物组培[23],但在本实验中,添加苹果泥和土豆泥对种子的萌发并无显著影响,可能这些有机物含有的维生素C、氨基酸或酶较少。

高丽伟[24]研究表明,在植物组织培养过程中,植物生长调节剂的种类和浓度对细胞增殖分化和器官发生起着重要的作用。外植体的诱导与培养基中植物激素和培养基的内源激素有关,培养基的植物生长调节剂浓度配比达到外植体的最佳浓度才能诱导丛生芽[25]。周艳等[26]研究表明,添加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L适宜硬叶兜兰原球茎的分化;杨燕萍等[27]在亨利兜兰原球茎增殖分化的培养基中添加0.2 mg/L 6-BA和2.0 mg/L NAA,丛生芽的增殖倍数较高。本实验中,在两种培养基中加入0.2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA(浓度比为2∶1),种子的萌发率得到显著提高,说明适宜浓度的植物生长调节剂对种子萌发有促进作用。为了实现最佳的促根生理效应,值得探索两种激素最佳配比的组合浓度[28]。不同兜兰属植物对植物生长调节剂浓度具有不同的需求,这可能是不同物种内源激素水平差异所致。此外,NAA对芽的生长起促进作用,IBA 对根的生长起促进作用,因此,寻找这两种激素的最佳比例可以潜在地提高兜兰属植物在组织培养中的整体生长和发育水平。

壮苗生根是增强组培苗对外界环境的适应能力和抵抗能力的关键环节,移栽后能大幅度缩短缓苗时间,加快幼苗生长[29]。不同成分的培养基对壮苗生根有不同影响。本研究发现,H培养基中幼苗根系长而健壮,移栽后成活率高;I培养基中幼苗根系较短,植株生长也相对较弱,移栽后的植株长势不如前者好。移栽基质是移栽成活的关键因素,兜兰的移栽基质一般选择火山石、松树皮、泥炭土、泥炭藓等及其混合基质[30],如长瓣兜兰、小叶兜兰和杏黄兜兰适宜用保水保肥较好的水苔[31-32];亨利兜兰、麻栗坡兜兰和百花兜兰适宜用保湿沥水、通风透气、养分丰富等优点的松树皮[27,33]。而在紫纹兜兰的栽培实验中,腐殖土和松树皮配比1∶1(体积比)混合是移栽最优基质,共移栽30株组培苗,成活率高达90%。组培苗管理也是影响长势的因素之一,如光照、水分、通风、肥水和病虫害等,都需要制定科学合理的管理标准。

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