四倍体小麦GPAT基因家族比较分析

师毅君，王康君，郭明明，张广旭，谭一罗，李晓峰，何茂盛，徐大勇，樊继伟

（连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000）

甘油-3-磷酸酰基转移酶（glycerol-3-phosph-ateacyltransferase, GPAT）是三酰甘油（Triacylglycerol, TAG）生物合成的关键酶，催化并限制其第一步反应的速度，是细胞膜、表皮蜡质、种内油脂等重要组分，对植物生长发育及抗逆能力具有重要影响［1］。具体而言，GPATs分为两类：一类为sn-1型GPAT，负责将脂肪酰基从酰基-酰基载体蛋白（-acyl-ACP）或酰基辅酶A（-acyl-CoA）向sn-1转移；
另一类属于sn-2型GPAT，具有磷酸酶活性［2-4］。目前，已在多种植物中鉴定到GPAT基因家族成员，如拟南芥［5］、棉花［6］、玉米［7］、青稞［8］、大麦［9-10］等，其中，拟南芥GPAT家族包含10个成员［5］，ATS1和AtGPAT9 属于sn-1型GPAT，AtGPAT1~8 为陆生植物特有的sn-2型GPAT，这些酶参与磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）［11-12］、植物膜脂、植物油脂、角质和软木脂［4,13］等多种脂质的生物合成［14］。研究发现，GPAT在植物响应冷、热等胁迫中起着关键作用［15］，例如，在不同抗冷性水稻中，GPAT核苷酸和推导氨基酸序列差异与抗冷性差异正相关［16］。番茄LeGPAT基因表达受低温诱导，过表达可以提高甘油-3-磷酸酰基转移酶含量而增强植株的耐冷性，抑制表达则可以增强耐热性并影响番茄的育性［17］。百合LpGPAT基因也被证明与低温胁迫有关［18］。在水稻品种J9516的叶绿体类囊体膜磷脂分子中，不饱和PG含量较高的植株能抵御低温诱导的光抑制作用［16］。反之，GPAT酶通过提高质体中类囊体膜脂的饱和度来增加植物对高温的耐受性。颜坤等［19-21］研究发现，高温胁迫下，转入GPAT基因的烟草类囊体膜上脂质饱和度增加，其光合速率较野生型的变化慢。

四倍体小麦分为硬粒小麦和野生二粒小麦，是栽培小麦的近缘物种，近年来，随着其基因组测序的完成，已逐渐成为新的研究热点，许多其他关于GPAT基因及其功能的类似研究已经被报道［14,22］。然而，人们对该基因家族在四倍体小麦中的作用知之甚少，特别是它们在冷或热胁迫中的潜在作用。为了解四倍体小麦中GPAT基因家族进化及其功能，本研究通过比较基因组学系统分析硬粒小麦和野生二粒小麦GPAT基因家族的结构特性，进化关系等内容，为深入探索麦类作物GPAT基因家族的功能提供更多的信息。

1.1 四倍体小麦GPAT基因家族成员的鉴定及理化性质分析

从植物参考基因组数据库EnsemblPlants（https://plants.ensembl.org/index.html）下载硬粒小麦、野生二粒小麦以及拟南芥的基因组数据，包括基因组序列文件、注释文件、蛋白序列文件。利用从Uniportswissport（https://www.uniprot.org/）下载拟南芥GPAT蛋白序列，在Pfam网站（http://pfam-legacy.xfam.org/）下载GPAT蛋白保守结构域（PF01553）的隐马尔可夫模型，使用TBtools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）软件［23］在硬粒小麦和野生二粒小麦蛋白质库进行BLASTP和HMMER搜索，得到包含结构域模型的蛋白序列。将HMMER和BLASTP的结果去冗余后，将序列提交到NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）数据库对其结构域进行鉴定，保留包含有完整结构域的基因。通过网站ExPASY（https://www.expasy.org/）来分析硬粒小麦和野生二粒小麦GPAT基因家族成员分子量、等电点等理化性质，并用网站WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）来预测其家族成员的亚细胞定位信息。

1.2 四倍体小麦GPAT基因家族系统发育分析

使用软件MEGA 11.0软件内置muscle对硬粒小麦、野生二粒小麦、拟南芥的所有GPAT基因进行多序列对比分析，使用邻接法Neighbor-joiningTree构建GPAT基因家族系统进化树，Bootstrap值取1000。通过网站ITOL（https://itol.embl.de/）进行美化。

1.3 四倍体小麦GPAT基因家族基因结构和保守结构域分析

硬粒小麦、野生二粒小麦和拟南芥GPAT基因结构分析使用TBtools软件中Visualize Gene Structure（Basic）工具，根据其基因组注释gff3文件提取内含子和外显子信息；
通过网站MEME（http://memesuite.org/）预测蛋白的保守结构域（Motif设为10）；
通过网站NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）确认GPAT家族成员的保守结构域。使用TBtools软件的GeneStructureView工具将上述结果进行合成及可视化。

1.4 四倍体小麦GPAT基因家族共线性分析

根据硬粒小麦、野生二粒小麦和拟南芥全基因组及注释文件，使用TBtools对其进行可视化的共线性关系分析，以此发现三者GPAT基因家族间的同源基因对。

2.1 GPAT基因家族成员的鉴定结果及理化性质分析

利用拟南芥GPAT蛋白序列，在硬粒小麦和野生二粒小麦蛋白质库进行BLASTP和HMMER搜索鉴定，最终确定硬粒小麦和野生二粒小麦各有33个GPAT基因家族成员。由表1可知，GPATs蛋白质成员的氨基酸长度为149（TdGPAT19）~589（TtGPAT1），分子量为16.22 kDa（TdGPAT19）~62.76 kDa（TtGPAT1），等电点为5.92（TdGPAT5）~11.39（TdGPAT7），但绝大多数蛋白（56个）的pI大于8，说明大多数GPATs蛋白富含碱性氨基酸，属碱性蛋白。亚细胞定位结果显示：有40.9%成员定位在质膜，25.7%成员定位在叶绿体，12.1%成员定位在内质网，10.6%成员定位在细胞液，6%成员定位在线粒体，1.5%成员定位在细胞壁，1.5%成员定位在细胞核，1.5%成员定位在液泡，结果暗示GPATs蛋白成员参与不同过程。

2.2 GPAT基因家族系统发育分析

为解读GPAT基因家族成员进化关系，以拟南芥、硬粒小麦和野生二粒小麦构建系统发育树（图1），将76个GPAT基因家族成员大致划分为3类：其中GroupⅠ（5个）约占6.57%，GroupⅡ（16个）约占21.05%，GroupⅢ（55个）约占72.36%，Group Ⅲ中又分为3个小类（Ⅲ-a有21个、Ⅲ-b有8个、Ⅲ-c有26个），3个植物GPAT基因家族成员在3个大类中的分布见表2。

图1 拟南芥、硬粒小麦、野生二粒小麦GPAT基因家族进化分析

表2 GPAT基因家族成员在系统发育树的分布情况

2.3 基因结构和保守结构域分析

为了进一步研究GPAT蛋白质的结构域，以此推测相同结构域可能具备的功能，利用MEME在线软件对GPAT成员蛋白序列进行分析，如图2A所示，同一分组的大多数家族成员具有相似的Motif构成，GroupⅠ和GroupⅡ的Motif缺失较为严重，而GroupⅢ几乎涵盖所有Motif，所有家族成员均含有Motif-2，推测该Motif可能具有特别的生物学功能。其中，Group Ⅰ除硬粒小麦GPAT蛋白成员外其他成员仅含有Motif-2。GroupⅡ所有GPAT蛋白成员均含有Motif-1、Motif-2，部分GPAT蛋白成员有Motif-3、Motif-5、Motif-7、Motif-9。

图2 GPAT蛋白质保守基序（A）、保守蛋白结构功能域（B）和基因结构分析（C）

同时，从图2-B可知，GPAT家族成员中共检测到7个保守蛋白结构功能域，其分组与系统发育树的聚类分析相似，在保守结构域方面进一步支持了GPAT基因家族分类。其中，GroupⅠ家族成员蛋白结构域较为保守，在组内成员中均发现PLN02349结构域；
GroupⅡ组内成员保守结构域多样性较高，鉴定到PLN02833、LPLAT_LPCAT1-like、LPLAT结构域；
GroupⅢ中发现PLN02177、PLN02499、PLN02588结构域。

硬粒小麦与野生二粒小麦GPAT基因家族结构大致可以分为2类，这与大麦和青稞在基因结构方面表现相似［8,10］。如图2C所示，GroupⅠ和GroupⅡ内基因的内含子较多，大多在7~12个之间，硬粒小麦中TtGPAT2、TtGPAT6、TtGPAT30、TtGPAT32，野生二粒小麦中TdGPAT2、TdGPAT11、TdGPAT31、TdGPAT32的内含子最多，由12个内含子组成；
GroupⅢ内的基因结构较为简单，插入的内含子较少，大部分在1~3个之间。

2.4 共线性分析

对拟南芥、硬粒小麦和野生二粒小麦进行共线性分析，结果表明：硬粒小麦和拟南芥基因组中仅有2个基因存在共线性关系，硬粒小麦和野生二粒小麦的共线性基因对数目为66个，说明四倍体小麦组间关系较为亲密（图3）。

图3 GPAT基因在拟南芥、硬粒小麦和野生二粒小麦间的共线性分析

本研究从硬粒小麦和野生二粒小麦中各鉴定到33个小麦GPAT基因家族成员，在数量上超过了大麦、青稞等其他禾本科作物。理化性质结果表明：GPAT成员氨基酸长度为149（TdGPAT19）~589（TtGPAT1），分子量为16.22 kDa（TdGPAT19）~62.76 kDa（TtGPAT1），等电点为5.92（TdGPAT5）~11.39（TdGPAT7），但绝大多数蛋白（56个）的pI大于8，说明大多数GPATs蛋白富含碱性氨基酸，这与其他物种相似。

系统进化分析表明，四倍体小麦GPAT家族成员可分为3个分支，与拟南芥、玉米、大麦等其他物种研究结果相似［6-7,10］，硬粒小麦和野生二粒小麦GPAT家族成员分布在3个分支的基因数量几乎一致，表明四倍体小麦组间相似性较高。结合基因结构分析，GroupⅠ和GroupⅡ内大部分成员含7~12个内含子，GroupⅢ内大部分成员仅含1~3个内含子，表明相同亚家族中GPAT基因有着相似的基因结构，且其进化进程和基因功能也具有一定的相似性。共线性分析显示，硬粒小麦基因与拟南芥的共线性较低，但是与野生二粒小麦的共线性关系较高，说明四倍体小麦之间亲缘关系更近。

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