影响种猪常温精液品质检测结果的因素分析

段晓红 解冰辉 骆 菲 罗文学 郭彦军 张军辉 马军红 和利民 刘廷玉 王贵江

(河北省畜牧良种工作总站，河北石家庄 050061）

种猪常温精液的品质直接影响母猪受胎率和产仔数[1]，精液质量的好坏需要进行检测评价，评价检测指标是按照种猪常温精液国家标准（GB 23238-2021）执行[2]。精液剂量、精子活力、精液密度、精子畸形率是种猪常温精液国家标准规定的4 项常规检测指标。近年来，为了推进生猪种业振兴，加强生猪良种补贴项目的监督管理，需不定时抽检种猪常温精液，保证种猪精液质量，严把种猪精液质量关，提高技术人员业务素质和技能水平[3]。随着种猪人工授精技术的普及，种猪常温精液在生产前、生产后和使用前，都必须进行精液质量检测，合格的精液才能用于配种，场内种猪常温精液检测工作在种猪场尤为重要[4,5]。由于非洲猪瘟等疫情的发生，很多猪场放弃饲养种公猪，通过从外界购买种猪常温精液来进行品种改良[6]。因此，种猪常温精液检测这项工作成为实验室人员和猪场负责精液生产人员的一项重点工作。

精液质量检测过程中保证数据的准确性尤为重要，精准数据是评估种公猪个体价值的重要依据，也可为种公猪站指导种猪饲养、猪舍环境、人工采精、稀释倍数等指标提供科学依据，但是检测过程中影响种猪常温精液检测指标数据准确性的因素很多[7,8]。目前，实验室检测工作中影响种猪常温品质检测结果因素总结性的文章较少，按照国家标准种猪常温精液检测指标（精子剂量、精子活力、前向运动精子数和畸形率）质量要求，笔者从影响种猪精液剂量、精子活力、精子密度和精子畸形率4 个检测指标进行分析，避免检测过程出现较大误差，为便于实验室检测人员按照国家标准进行准确操作和保证种公猪站产品的质量，同时帮助养殖户买到质量可靠、放心的种猪常温精液提供参考。

精液剂量是种猪常温精液国家标准规定的检测指标之一，是评判检查结果是否合格的一项指标。检测质量要求受体为引进或培育猪种，用于常规输精剂量≥80 mL/剂；
用于深部输精≥60 mL/剂。受体为地方猪种则输精剂量≥40 mL/剂。

1.1 天平称量

目前，种猪常温精液国家标准（GB 23238-2021）剂量检测方法是使用称量法[2]。影响天平称量准确性的因素有：天平应放在独立天平桌上、避免外界环境对其产生影响、每年需对天平进行校准、使用前检查电子天平运行的状况、称量前先清零，再称重记录等，记录数据时，要避免人为记录错误。

1.2 精液瓶标签

完善精液瓶标签信息是了解精液质量及信息的依据之一，生产种猪精液的厂家应引起重视。根据标签上精液用于深部输精还是常规输精，国家标准质量要求是不一样的。判断精液剂量是否合格时，若标签上尚未标明是用于常规或者深部输精，易造成无法正确判断精液剂量检测结果，比如：受体为引进或培育猪种，常规输精≥80 mL/剂；
深部输精≥60 mL/剂，则为合格。受体为地方猪种输精剂量≥40 mL/剂，则为合格。不同输精方式和受体品种的判断标准不同。

1.3 空包装的称量

当送检厂家提供放置精液的空包装时，直接进行精液的称重检测，一般不会影响检测结果。当送检厂家没有提供空包装时，需要检测人员倒出瓶内的精液，在清洗干净、干燥后再称量空包装的重量，否则可能会影响精液剂量检测结果的准确性。目前市场精液包装有3 种，分别为袋装、瓶装和管装。瓶装称量清洗干燥比较容易，产生的误差小；
袋装和管装口较小，不方便清洗干燥，可直接从袋中间剪开进行清洗干燥再称量，称量前一定查看瓶盖等包装是否齐全。

1.4 结果

计算结果需要保留1 位小数，正确的数值修约反映了检测结果的精确度，应按照GB/T8170 的规定进行修约。

精子活力是指精液中呈前进运动的精子所占的百分率。当精液温度在37℃左右时，以精液中向前运动精子数占总精子数的百分比表示。精液密度是每剂精液中呈前进运动精子的总数。密度指标在检测报告中不体现，但这是保证做前进运动精子数的重要指标。常温精液精子活力和密度是种猪配种效果的关键指标。

2.1 影响精子活力的因素

2.1.1 精液运输

刚接收到的样品立即检测精液活力，活力往往不好，原因可能是运输过程中应激疲劳导致，等一段时间后再进行检测，可使精子恢复一定活力。周琳[9]研究发现，精液运输期间，精液需要应对各种应激，温度变化、运输振动都会引起精液活力异常，剧烈振动会提高精液pH 值和氧化应激水平，还会影响线粒体活性，从而影响精子运动能力。运输时应使用车载冰箱，冰箱需通过质检并合格，冰箱中放置温度计以检测温度是否正常，保证样品在16～18℃下避光密封运输，运输过程中避免强烈振动和碰撞。

2.2.2 精液保存的温度

温度是精液质量控制的关键环节，精液应保存在17℃恒定温度下，在检测过程中为避免出现温度不稳定等问题，可将精液保存在恒温箱中，避免精液活力降低。曾琼[10]等研究表明猪精液对高温比较敏感，温度越高，精子运动越快，消耗的营养与能量越多，保存时间越短。所以，种猪常温精液最佳温度控制在16～18℃。李军伟[11]等研究表明，与17℃相比，22℃和37℃保存精子活率和活力在24 h 后显著下降，37℃下保存促进了精子由早期凋亡向晚期凋亡的转化，破坏了精子的调节机制，不利于精子的存活。

2.2 影响精子活力和精液密度检测的因素

2.2.1 计算机辅助精子分析

计算机辅助精子分析（Computer-aided sperm analysis,CASA）系统是使用电脑技术进行精液质量分析的仪器[12]，可以有效降低人为目测读数误差大等问题。目前市场上计算机辅助精子分析软件很多，但是分析软件要符合猪常温精液国家标准规定的技术参数，否则会影响精子活力数值。

2.2.2 显微镜调节

亮度、焦距等调节不到位会引起精子检测系统无法被识别，影响精子活力检测结果，可通过调节聚光器，直至视野光线最佳。

2.2.3 腔室玻片

在使用CASA 系统分析精子活力及密度时，腔室玻片与载玻片和盖玻片在使用方面有着很大差异，所以检测过程中一定注意使用配套的腔室玻片。腔室玻片检测图像清晰，容易抓拍精子，不分层，CASA 系统能够更准确地进行分析。普通的玻片点样时会出现分层，导致软件不能够准确分析，甚至超出系统估计数值，无法分析数据。标准规定腔室玻片高度为（20±2）μm 最佳。陈亚静[13]等研究发现，不同品牌的专用玻片在（20±2）μm 高度下使用CASA 系统进行检测，差异不显著。

将莱卡腔室玻片和某厂家腔室玻片进行比较，发现使用某厂家玻片的精子瞬间死亡，可能是腔室玻片内的分隔线使用的胶水导致，误判检测结果为不合格。莱卡腔室玻片对精子活力无影响，但是价格偏高，为了保障检测结果的准确性，应选择质量好的腔室玻片。

2.2.4 取样方式

精液在静置时，精子易下沉至底部，影响取样的均匀度。应将精液样品摇匀后，倾斜约45°，将移液器的吸头伸入液面下15～20 mm 处，最佳取样的精液液面高度为1.5 cm。

2.2.5 摇匀方式和时间

摇匀是精液品质检测前中重要的步骤，正确的摇匀方式是上下轻轻旋转储精管，时间为2～3 min 左右。检测结果表明，检测活力指标摇匀时间1～5 min 均可，摇匀时间在5 min 以上易出现较大误差，2～3 min 则较为理想。陈亚静[14]等研究表明，种猪常温精液在不同密度下对母猪受胎率与产仔数有影响。

2.2.6 翻转

精液样品储存时，应定时定点进行样品的翻转。长时间不翻转样品，精子之间易聚集、缠绕和粘连[15]，从而影响精子密度和活力。

2.2.7 温度

37℃恒温台预热是猪精液活力质量控制的关键环节。通过试验比较发现，预热载物台控制温度精准程度是关键，当温度低于37℃时，精子活力不佳，精子尾巴弯曲，不进行直线运动，可能会抑制精子的活动能力和代谢速度；
当温度高于37℃时，可以提高精子的活动能力和代谢速度，但会缩短精子的生存时间，精子很快活跃完毕并死亡。载物台温度应该保持37±1℃，载物台温度需经过检测，保证温度在要求的范围内使用，以提高检测结果的准确性。

2.2.8 预热时间

由于检测使用的腔室玻片空间有限，精液量有限，如果预热时间过长，精液液体易干燥或减少，从而抑制精子活力，所以取样之前最好摇匀并吸取精液到1.5 mL小试管中，在水浴锅内先预热，等到精液预热后再点样进行检测，检测结果活力更佳，但是需要注意水浴锅的温度，防止水浴锅温度不稳定，降低或提高精子活力，造成结果不准确，精液预热的时间为1～3 min。李平[7]等研究发现，精液在37℃下预热3～5 min 活力最好，专用玻片取样是5 μL，普通载玻片取样20 μL，由于使用的玻片不同，预热时间也不同。

2.2.9 检测精液时间

腔室精液液体比较少，观看时间长，易导致后续观察视野的精子死亡，影响最后结果的平均值，最终影响精子活力检测结果。

2.2.10 移液器

移液器的正确使用与精液密度分析有着密切的关系[4]，移液器分两个档，如果用2 档点样会导致制备的样品测出的密度不准确，需要重点学习移液器正确使用方法。移液器需要定期进行校正，每年至少送质检部门检测1 次。朱丹[4]等研究发现，移液器气密性、漏气需要及时检查处理，提高精液取样准确性。

2.2.11 检测结果

检测精子活力需要做2 个平行样，每个平行样测定3 个结果并取平均值，检测过程中2 个样品点计算结果相对偏差应小于5%，大于5%则应重检。如果检测结果不合格，需多次重复进行检测，防止出现误判。精子活力计算结果需要保留1 位小数；
精液密度读取结果，保留至小数点后3 位。

2.2.12 仪器检测校正

仪器在使用一段时间后需要进行校正。校正方法有血球计数板法、仪器法。

血球计数法检测：将每份样品检测2 次，2 次检测结果之间的相对偏差应小于5%，否则重检，用2 次检测结果的平均值表示该样品的检测结果。同一份样品至少由2 人进行精子密度检测，2 人检测结果之间的相对偏差应小于5%，否则重检。仪器法检测：对血球计数法中的同一样品，按仪器法的步骤检测精子密度，至少2 次。仪器检测结果之间的相对偏差应小于5%，否则重检。当检测结果满足要求时，取其平均值作为仪器法的最终检测结果。将血球计数法和仪器法的最终检测结果进行比对，若两者之间的相对偏差小于5%，则精子质量分析仪完成校正。否则应按照精子质量分析仪的参数设置程序，调整精子密度检测的相关参数，并重复血球计数板法的步骤，直至血球计数法和仪器法检测结果之间的相对偏差小于5%。

精子畸形率是指精子的形态发生异常的数量占总精子数量的比率，精子正常分为头、体、尾3 部分，如果形态发生异常就称为畸形。最常见的为头部畸形，如大头、双头、无头，头部变得粗大、折裂甚至不完整；
尾部发生卷曲，双尾、缺尾、断裂等。精子形态发生异常以后，会影响精子的受精能力。影响精子畸形率检测结果因素是抹片，抹片操作不当很容易造成精子畸形，原因就是推动样品到另一侧时没有与载玻片呈约35°夹角，直接紧挨载玻片推动，很容易造成断头断尾，使精子畸形率上升[16]。正确方法是用移液枪吸取10 μL 样品滴于载玻片一端（吸取剂量根据精液密度调节），将推片的边缘与载玻片呈约35°夹角向另一侧缓慢推动，将样品均匀地涂抹在载玻片上。

综上所述，种猪常温精液品质检测结果准确性尤为重要，笔者对在实验室检测过程中发现的问题进行了系统的整理分析，把影响精液检测结果因素进行了详细阐述，一方面为从事精液检测的工作人员提供参照依据，另一方面为减少精液检测时出现较大误差，精准的检测结果可以用于指导分析种猪场现有的问题，从根本上改善种公猪质量，从而提高生猪精液品质，为养殖户能够放心购买精液，为生猪良种补贴项目起到真正的作用，对生猪生产具有重要意义。

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