不同载体表面及糖暴露后具核梭杆菌黏附及生物膜特性

邵青意 冯丹峰 虞臻迪 陈丹蕾 计友棋 程东庆

具核梭杆菌（F.nucleatum）是梭杆菌门梭杆菌属的代表细菌，目前研究主要聚焦于溃疡性结肠炎、克罗恩病，尤其是结直肠癌［1］。消化系统存在口腔-肠道微生物群轴，F.nucleatum不仅聚集于结肠，也大量定居于口腔微环境［2-3］，是导致牙周病的主要病原体。F.nucleatum在口腔中具有高致病性与强侵袭性，在生物膜结构中作为“组织者”，连接早期定植微生物与晚期定植微生物、共生菌与致病菌［1］。F.nucleatum通过黏附素RadD、孔蛋白FomA及脂肪酸结合蛋白2（fattyacid-binding protein 2，Fap2）的介导，与后期病原微生物牙卟啉单胞菌等实现共聚与黏附，从而帮助其定植［1］。细菌生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有一定三维结构和功能的细菌群体［4］。在复杂的口腔微环境内，细菌生物膜易形成于多种材料表面，人造材料上的口腔生物膜影响假牙和修复体的使用寿命，还会导致种植体周围炎等疾病［4］。同时，不同碳水化合物饮食可以促进或预防龋齿生物膜的发展［5］。本文探讨F.nucleatum在不同口腔材料表面的聚集、黏附与生物膜形成特性，以及常见糖暴露的影响，旨在了解其在复杂的口腔微环境中的定植情况，揭示F.nucleatum在不同口腔条件下的致病力。

1.1 菌株、主要试剂与仪器 菌株：F.nucleatum多形亚种（Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum）BNCC336949保存于本实验室。主要试剂与材料：蔗糖（麦克林）、乳糖（麦克林）、木糖醇（阿拉丁）、牛心脑浸液培养基（海博生物）、琼脂粉（杭州滨和微生物）、氯化血红素（源叶生物）、微生物K1注射液（海博生物）、无菌脱纤维羊血（源叶生物）、厌氧袋（三菱，日本）、钛片（购自淘宝海源科研金属）、树脂义齿（购自淘宝丞诚口腔材料模具）、24孔板（康宁）等。主要仪器：多功能酶标仪（Tecan，瑞士）、微孔板分光光度计（Bio Tek，美国）、场发射扫描电子显微镜（日立，日本）等。

1.2 样品处理 钛片使用喷砂机于不同颗粒大小石英砂45 m、125 m、350 m加工，在100℃下，60%H2SO4、10%HCL和去离子水以1∶1∶2体积比组成的混酸中酸蚀20 min，加工成粗糙度为0.1 m、0.5 m、1.5 m、3.0 m及4.0 m五组微米结构表面钛片。所有纯钛钛片试件先用0.9%氯化钠溶液洗涤3次，再用无水乙醇超声降解15 min，高压蒸汽灭菌备用。树脂义齿用无水乙醇超声降解15 min，高压蒸汽灭菌备用。

1.3 细菌培养与实验菌悬液制备 将冻存的F.nucleatum接种至含1%维生素K1和氯化高铁血红素储备液（50 mg氯化高铁血红素、1 mL微生物K1注射液/100 mL）的BHI血平板，37℃厌氧培养，24～36 h可形成菌落，应用革兰染色进行纯度鉴定。将上述单菌落接入含10%小牛血清的BHI液体培养基中，37℃厌氧培养36 h，将菌液离心（1,000 r/min，5 min），使用无菌PBS重悬，并将菌悬液调节至A600值为0.8。

1.4 F.nucleatum自聚集 细菌自聚集是指菌体在培养过程中，大量并快速繁殖从而导致其自行聚集成团的现象。不同载体环境：将1.2中钛片、树脂义齿分别置于24孔板内，设置聚苯乙烯对照组，加入实验菌悬液，37℃培养48 h，形成稳定生物膜。参考文献［6］中方法，应用无菌聚集缓冲液（150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Tris-HCL pH 8、0.1 mmol/L CaCl2和0.1 mmol/L MgCl2）将F.nucleatum生物膜超声（100 Hz，10 min）洗脱、重悬，于A600测吸光度记作A0，静置，每30 min离心生物膜悬液（2,000 r/min，2 min），取上清液于A600测吸光度记作At。不同糖培养基环境：F.nucleatum于含有1%不同糖（蔗糖、乳糖、木糖醇、空白培养基）的培养基中37℃培养48 h，收集生物膜，检测方法同上。聚集率计算：Aggregation %=（A0-At）/A0×100%。

1.5 F.nucleatum黏附作用 细菌黏附作用是指细菌可通过黏附素附着在载体或宿主细胞表面。不同载体环境：将1.2中钛片、树脂义齿分别置于24孔板内，设置聚苯乙烯对照组，加入实验菌液，37℃厌氧分别培养0 h、2 h、4 h、6 h、8 h。将试件用PBS冲洗3次，99%甲醇固定15 min，参考文献［7］，在干燥后用1%结晶紫溶液染色5 min，PBS洗涤干燥后加入33%乙酸混匀溶解结晶紫，于A570处测定各时间点吸光度值。不同糖培养基环境：F.nucleatum于含有不同糖的培养基或原培养基（空白对照）中37℃培养0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，检测方法同上。黏附率（%）=（Ath-A0h）/A0h×100%。

1.6 电镜表征不同粗糙度钛与F.nucleatum黏附时期形态 菌悬液于每组粗糙度试件表面培养6 h后，取出试件，用PBS冲洗试件3次，立即放入2.5%戊二醛溶液中，4℃过夜，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脱水，干燥，喷金，扫描电镜表征黏附时期不同粗糙度钛片表面细菌形态。

1.7 F.nucleatum生物膜形成 细菌生物膜形成通常包含细菌与底物表面通过黏附因子相互作用阶段，微菌落形成阶段，生物膜成熟阶段，细菌脱落或扩散阶段。不同载体环境：将不同粗糙度试件、树脂牙齿分别置于24孔板内，设置聚苯乙烯对照组，加入实验菌悬液，37℃厌氧分别培养12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，参照1.5中步骤，得到各时间点生物膜总量。不同糖培养基环境：F.nucleatum于含有不同糖的培养基与原培养基中37℃培养12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，检测方法同上。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism进行数据统计学处理与绘图。

2.1 自聚集能力 蔗糖培养基中的生物膜内F.nucleatum在30 min时自聚集率为60.58%，在90 min时达到69.43%；
其次为乳糖培养基，其中生物膜内F.nucleatum在30 min时自聚集率为43.36%，90 min达到51.58%；
最后为木糖醇与普通培养基组（30 min分别为36.50%、37.00%；
90 min分别为34.39%、44.04%）（见图1A）。蔗糖组F.nucleatum自聚集率大于其他组。载体组F.nucleatum自聚集率除聚苯乙烯组均在30 min达到最大值，0.1 m、0.5 m、1.5 m、3 m、4 m钛片、聚苯乙烯、树脂义齿组最大自聚集率分别为36.14%、53.76%、46.18%、45.08%、44.83%、50.22%与49.87%（见图1B）。

图1 不同载体表面、不同含糖培养基F.nucleatum生物膜细菌自聚集率

2.2 黏附作用 F.nucleatum具有较好的黏附作用，在8 h内能够黏附在不同粗糙度钛片、树脂义齿、聚苯乙烯板条上，在含不同糖的培养基内也能够黏附于载体表面。不同载体组，8 h时，聚苯乙烯板条表面F.nucleatum黏附率最高，为548.00%，除4.0 m钛片组与聚苯乙烯板条组外，其余均在6 h达到最大黏附率，完成黏附。6 h时0.1 m钛片、0.5 m钛片、1.5 m钛片、3.0 m钛片组黏附率分别为98.00%、180.00%、177.00%、40.00%。不同糖培养基组，8 h时蔗糖组F.nucleatum黏附率最高，为370.00%。除蔗糖组外，其余不同含糖培养基均在6 h达到最大黏附率，完成黏附。6 h时乳糖、木糖醇、培养基组黏附率分别为196.00%、144.00%、97.00%。见图2。

图2 F.nucleatum黏附时期不同载体、培养基内黏附情况与黏附率

2.3 扫描电镜表征钛表面不同粗糙度与钛表面黏附时期细菌形态 扫描电子显微镜下表征不同粗糙度钛片表面，可见细微划痕于光滑钛片表面，深浅不同的微米凹坑分布于不同粗糙度钛表面，0.5 m钛表面多为2 m直径凹坑，其余粗糙度钛片表面凹坑大小不一、深浅不一；
粗糙度越大，凹坑越致密。钛片表面F.nucleatum黏附6 h经扫描电镜发现相同放大倍数时随机视野下可见随着钛表面粗糙度变大，黏附的细菌数量增加，F.nucleatum菌体变长。在材料表面凹陷处，细菌聚集更为显著。粗糙度大的钛表面，为细菌提供容纳场所，从而在初期抵抗外界流水冲刷，使其能够更好黏附于载体表面。见图3。

图3 钛表面F.nucleatum黏附时期扫描电镜图像

2.4 F.nucleatum生物膜形成 F.nucleatum在所有载体表面均能够形成生物膜。生物膜在2 d时成熟：除了0.1 m、3 m钛表面外，其他粗糙度表面与聚苯乙烯表面F.nucleatum生物膜均在2 d时到达峰值。聚苯乙烯表面F.nucleatum生物量最大，其次为4 m钛片、1.5 m钛片表面，0.1 m钛片表面生物量最小。F.nucleatum生物量在所有材料表面均于3 d后开始减少，生物膜结构逐渐衰老、瓦解。不同含糖培养基组，在蔗糖作用下生物膜含量最大，在48 h为A570=3.75，其次为乳糖组、纯培养基组、木糖醇组。所有组内生物膜均在2 d时达到最大生物量，生物膜成熟，在3 d后开始减少，生物膜逐渐瓦解。不同培养条件下48 h生物膜结晶紫染色后形态观察，含蔗糖培养基内生物膜生物膜明显大于其他培养基，且不同载体表面均有生物膜形成。见图4。

图4 F.nucleatum生物膜形成时期生物量

F.nucleatum是口腔龈上和龈下生物膜中丰度最高的革兰阴性厌氧菌之一，是健康和疾病牙周微生物群的重要组成［3，8］。F.nucleatum聚集作用强，介导多种浮游细菌共聚集，聚集作用促进细菌聚拢成团，进一步加强其黏附作用［9］。同时，F.nucleatum作为一种“黏附型”微生物，其黏附能力强，在防止唾液冲刷的同时，还促进多微生物交流与代谢互作［10-11］。F.nucleatum与口腔微生物群其他成员有着互惠关系，与其他口腔微生物互作以驱动疾病发生，是生物膜形成的关键病原体［12-14］。口腔微生物群对口腔健康有重要作用，多微生物形成的生物膜转变为生态失调状态时，口腔微生物群可能导致多种疾病［15］。

在复杂的口腔环境中，F.nucleatum因其黏附、生物膜形成能力被认为可能有助于种植体周围疾病的发生和发展［16］。在种植体周围炎中，通过附着于牙龈和种植体表面的生物膜形成群落，继而破坏周围组织。F.nucleatum在口腔内繁殖，分泌代谢产物，刺激牙龈组织，导致牙龈发炎和出血［15］。本研究发现F.nucleatum在大部分载体表面都能够黏附并形成良好的生物膜。在蔗糖的存在下，相比于其他培养基，该细菌的黏附与生物膜形成能力均较强。提示临床对于潜在F.nucleatum感染的患者应该注意减少蔗糖摄入，从而减少牙齿疾病的发生。

本研究发现，F.nucleatum在不同载体表面与不同糖暴露下均有良好的聚集、黏附与生物膜形成能力。已有研究发现，这可能来源于其黏附素的作用，F.nucleatum产生淀粉样蛋白特性黏附素FadA，介导了良好的种间共聚集能力、黏附能力和多物种生物膜形成，使其在生物膜形成过程中充当支架，同时赋予其耐酸性使其能够存活于口腔微环境［17］。ENGEVIK等［18］发现F.nucleatum通过RadD黏附素黏附在艰难梭菌，并增加生物膜形成与胞外多糖的产生，提示F.nucleatum通过黏附素发挥良好的黏附能力，增加生物膜形成。各种研究均发现F.nucleatum在黏附素介导下具有良好的黏附与生物膜形成能力，这也提示后续可以针对黏附素进行其致病性研究。本研究发现，F.nucleatum在不同载体上与不同糖暴露后均有优良的聚集、黏附、生物膜形成能力。电镜观察下随着粗糙度增加，黏附细菌数量增加，但黏附率在3 m时减小，这可能由于电镜观察存在选择偏差。

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