基于HS-SPME/GC-MS/O,分析滇绿茶特征香气物质

杨 雪，王 静，2，胡月朦，韦朝领，2，翟小婷，2*

（1.安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；
2.安徽农业大学 茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥 230036）

滇绿茶，即云南绿茶，产于云南省临沧、保山等地［1］。滇绿茶选用芽叶肥壮，茶多酚含量高的云南大叶种鲜叶做原料，精选细嫩的一芽二叶，经过杀青、揉捻、烘干等工艺处理制成。由于高温杀青，及时揉捻，抑制了酶活性和多酚氧化，防止了芽叶过度发酵，使得滇绿茶保持黄绿的色泽，形成滋味醇浓、香气持久、回味悠长、汤色黄绿的特点［2］。

绿茶香气类型可分为栗香型、清香型与花香型等［3］。绿茶香气物质含量低、组成复杂，因而较难分析。近年来，Feng等［4］采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术证明了不同工艺可赋予六大茶类不同类型的香气特性。张铭铭等［5］采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GCTOF MS）技术明确了异丁醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛、苯乙醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮和β-紫罗兰酮是栗香型绿茶的特征香气物质基础。潘思竹［6］采用顶空分析结合GC-MS 鉴定出贵州6 种嫩栗香型绿茶中的53种挥发性成分，发现芳樟醇、β-紫罗兰酮、对伞花烃、茉莉酮、香叶醇和β-苯乙醇对绿茶的清香与栗香具有贡献作用。余胜奎等［7］采用同时蒸馏萃取（SDE）结合GC-MS 从滇绿茶和滇红茶中分别鉴定出74种和61种挥发性成分，并指出滇绿茶的特征挥发性成分为苯乙醛，滇红茶的挥发性成分为α-松油醇和β-蒎烯。

目前，滇绿茶的特征香气成分未见系统报道，关键香气物质不明确制约了滇绿茶的开发利用。HS-SPME 是一种选择性非溶剂萃取法，广泛应用于茶叶和茶汤的香气分析［3］。气相色谱-质谱/嗅闻技术（GC-MS/O）将仪器分析和人类嗅觉感官评价相结合，可分析食品中香气成分，其结果准确可靠，已成为食品风味分析领域的最主要方法之一［8］。本研究采用HS-SPME结合GC-MS/O分析滇绿茶的特征香气成分，可为滇绿茶的香气品质提升和工艺改进提供理论基础。

1.1 实验材料

26批滇绿茶样于2021年制作，来自云南当地茶叶企业，茶样信息见表1。

表1 滇绿茶样及来源Table 1 Dian green tea samples and their origins

（续表1）

1.2 香气标准品与试剂

二甲基硫醚、己醛、萘、水杨酸甲酯、香叶醇、β-大马士酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、2，3-辛二酮、苯甲醇和苯甲醛（美国Aladdin 公司）；
芳樟醇、二氢芳樟醇、苯乙醛、γ-松油烯、柠檬醛、2，4-二叔丁基苯酚和（Z）-3-己烯-1-醇（德国Dr. Ehrenstorfer 公司）；
α-柏木烯、2-庚酮、2-乙基呋喃、正己醇、（+）-柠檬烯、β-二氢紫罗兰酮、α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮（上海Macklin 公司）；
1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇、2-甲基戊醛和2-甲基丁醛（上海TCI公司）；
二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮（上海甄准生物科技有限公司）；
（E，E）-2，4-庚二烯醛、庚醛、癸醛、正戊醛、（E）-4-庚烯醛、β-环柠檬醛、茶香螺烷、（E）-β-罗勒烯和藏红花醛（加拿大TRC 公司）；
月桂烯、2-茨酮、间伞花烃、对伞花烃、雪松醇和C5～C30正构烷烃系列标准品（上海Sigma-Aldrich 公司）；
1-壬醇、4-萜烯醇、2-甲基萘、苯乙酮、茉莉酮、异佛尔酮、苯乙烯、对二甲苯、邻二甲苯、乙基苯、2-乙酰基吡咯、茶吡咯、吲哚、苯乙腈、N-甲基吡咯和3-乙基-2，5-甲基吡嗪（上海源叶生物科技有限公司）；
氯化钠、丙酮（分析纯，国药集团上海有限公司）；
纯净水（中粮可口可乐华中饮料有限公司）。

1.3 仪器与设备

20 mL 顶空进样瓶和7890B-5977B 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；
EX125DH 十万分之一分析天平（美国OHAUS 公司）；
ODP3 嗅闻仪（德国Gerstel 公司）；
50/30 DVB/CAR/PDMS 萃取头和SPME手动进样手柄（美国Supelco公司）；
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州市英峪予华仪器有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 传统感官审评和香气定量描述性分析传统感官审评：根据GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》［9］，在标准的茶叶感官审评室中进行传统感官审评。称取3 g 茶叶置于评茶杯中，以1∶50 的茶-水质量比用沸水浸泡5 min后，等速滤出茶汤，留叶底于评茶杯中。茶叶香气的感官审评由8位受过茶叶感官审评培训且有经验的小组成员完成，并记录各茶样的香气特征。

香气定量描述性分析（QDA）：从安徽农业大学招募25 名经验丰富的感官评定员（22～32 岁），组成感官评定小组并进行每周一次的专业气味训练，训练周期为1年以上。训练时，感官评定员嗅闻识别多种香气标准品水溶液、混合香气标准品水溶液的香气属性组成及其对应的化合物，并通过香气识别食物。此外，感官评定员要求通过参加GC-O 嗅闻样品以及参加感官实验加强嗅觉的灵敏度。香气定量描述性分析实验时，对样品进行整体气味评估以评估滇绿茶汤的香气轮廓和整体香气差异。参考感官评定员的初步嗅闻结果，选择以下8 种香气标准品水溶液作为滇绿茶汤的标准气味描述词，定义样品中的主要气味类别：苯甲醇（果香）、β-紫罗兰酮（花香）、吲哚（清香）、3-乙基-2，5-甲基吡嗪（烘烤香）、2-甲基丁醛（麦芽香）、苯乙醛（蜜香）、2，3-辛二酮（奶香）、己醛（青草香）。将选定的香气标准品以超过气味阈值100倍的浓度溶于水中，将标准品水溶液和茶汤（15 mL）分别装在有盖的无味玻璃瓶中（内径：40 mm，总体积：60 mL）。由每位感官评定员评估每个样品中各气味类别的气味强度，绘制整体气味强度的雷达图。气味强度分7个等级：“0”为无香气；
“0.5”为香气强度较弱；
“1.0”为香气强度弱；
“1.5”为香气强度中等；
“2.0”为香气强度较强；
“2.5”为香气强度强；
“3.0”为香气强度极强。

1.4.2 挥发性成分的提取富集采用HS-SPME 富集茶汤的挥发性成分［10］。以癸酸乙酯作为定量分析的内标物，采用标准加入法对待测物进行半定量分析。将3 g干茶置于250 mL锥形瓶中，按茶-水质量比1∶50，加入150 mL 开水，静置5 min 后，用纱布滤出茶汤，迅速置于冰水浴中冷却至室温。吸取10 mL 茶汤于顶空瓶中，加入2 g 氯化钠和1 µL 癸酸乙酯（10 mg/L），30 ℃水浴，磁力搅拌平衡15 min。SPME萃取头吸附30 min，在进样口解吸附5 min待分析。

1.4.3 GC-MS/O 条件［11］色谱条件：HP-5MS 熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 µm，美国Agilent公司），进样口温度为250 ℃，载气为氦气，载气流速为1 mL/min，不分流进样。柱温箱升温程序：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，再以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子轰击离子源正模式（ESI+），电子能量为70 eV，接口温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，单四极杆温度为150 ℃，采用全扫描模式，质量扫描范围30～350m/z。

嗅闻条件：ODP3嗅闻仪设置为200 ℃。GC-O感官分析由安徽农业大学的3名感官评定员完成。

1.4.4 GC-MS/O 实验 从气相色谱柱尾端洗脱出的待测物通过安捷伦Dean switch分流装置均匀分为2份，一部分通过一根空柱进入MS记录待测物的质谱信息和保留时间；
另一部分通过等长的空柱进入ODP3嗅闻仪，感官员从ODP3嗅闻仪嗅闻，记录待测物的气味属性和强度。气味强度采用5点刻度法：0表示未闻到；
1表示微弱；
2表示中等；
3表示较强；
4表示极强。每种物质的气味属性需要至少两名感官员描述一致才能确定，香气强度取平均值。所有实验至少重复3次。

1.5 数据处理

定性分析：根据C5～C30正构烷烃标准品的保留时间和保留指数（RI）计算公式，测定各色谱峰的RI。根据碎片离子质谱信息匹配NIST17.L谱库对待测成分进行结构鉴定。最后，通过比对香气标准品和待测物的气味属性、保留指数和质谱信息，确定香气物质的名称和化学结构［12］。

相对定量分析：以50 mg/L 的癸酸乙酯为内标物，认定校正因子为1，根据样品中各色谱峰与内标物峰面积的比值以及内标物浓度，测定挥发性成分的相对浓度和含量。所有实验至少重复3次。

2.1 不同小产区滇绿茶的香气物质差异

如图1 所示，根据产地将26 个茶样分为四组进行GC-MS 分析。图1A 中，S3 和S4 均为云南佛香茶，其色谱图差异较大，表明相同品种制得的茶叶也会因工艺参数和采摘嫩度不同而产生香气品质差异。大赛茶叶合作社生产的4 种滇绿茶色谱图（图1B）重合度很好，表明其香气品质的一致性较好。南涧县茶厂生产的13 个滇绿茶样产地相同，虽然其品种和生产时间差异较大，尤其是采摘时间从3月到10月包含了春茶和夏秋茶，然而上述茶样的挥发性成分色谱图轮廓大体相似，仅存在细微差异（图1C）。其他茶厂生产的滇绿茶香气差异更为显著（图1D）。

图1 4组滇绿茶样的总离子流图Fig.1 The total ion current chromatograms（TIC） of 4 groups Dian green tea samples

2.2 3种典型滇绿茶的传统感官审评与香气定量描述性分析

按照国家标准GB/T 23776-2018［9］，对26 批滇绿茶样进行传统感官审评，结果显示所有样品均符合上述标准。其中，S3 和S6 号样品表现为嫩香，但S6 号样品香气不持久；
S15 号样品表现为豆香和栗香，且香气较持久。上述3 个样品（S3、S6 和S15）的干茶、汤色、叶底和香气特征如图2 所示，其香气和滋味审评结果均为95分以上，说明其风味品质较好。故选择上述3 个样品进行香气定量描述性分析，以对滇绿茶汤的整体香气进行初步认识，结果如图3 所示。滇绿茶的香气轮廓包括果香、花香、清香、蜜香、奶香、烘烤香、麦芽香和青草香8 种主要气味特征。其中，S3 和S6 号样品花果香和蜜香的香气强度较高，S15号样品烘烤香和奶香的香气强度较高。3个茶样的整体香气馥郁，是典型的滇绿茶。综合传统感官审评和香气定量描述性分析结果，最终选择S3、S6和S15号样品进行HS-SPME/GC-MS/O分析。

图2 3个滇绿茶样品的传统感官审评结果Fig.2 The results of Chinese traditional sensory evaluation of three Dian green tea samples

图3 3个滇绿茶样品的香气定量描述性分析结果Fig.3 The results of aroma descriptive analysis of three Dian green tea samples

2.3 3种典型滇绿茶的GC-MS/O定性和嗅闻结果

上述3 个样品的香气物质定性分析结果如表2 和图4 所示。将GC-MS/O 分析结果与香气标准品的香气特征及强度、在HP-5MS 毛细管柱上的相对保留指数和在ESI+模式下的质谱信息比对，共鉴定出83 种香气物质，包括22 种脂肪烃和芳香烃、15 种醇、14 种醛、14 种酮、11 种杂环化合物、5 种酯、1种酚以及1种含硫化合物。3种滇绿茶汤中嗅闻到的香气属性主要有柑橘香、杏仁香、果香、花香、蜜香、薄荷味、青草香等，对应的香气物质主要有32 种，其化合物名称和香气属性分别为二甲基硫醚（玉米香）、2-甲基戊醛（杏仁味/花香）、己醛（青草香）、（E）-2-己烯醛（青苹果味/杏仁味）、（Z）-3-己烯-1-醇（莴苣味）、己醇（青草香/杏仁味）、2，5-二甲基-2-己醇（青草香/杏仁味）、庚醛（青草香）、苯甲醛（杏仁味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）、2，3-辛二酮（奶香）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（爆米花香）、月桂烯（柑橘味/花香）、（E，E）-2，4-庚二烯醛（花香）、3-乙基-2，5-甲基吡嗪（烘烤香）、芳樟醇（柑橘味/花香）、二氢芳樟醇（柠檬味/甜香）、α-环柠檬醛（番茄味）、（E）-β-罗勒烯（罗勒草香）、水杨酸甲酯（清凉/薄荷味）、藏红花醛（药草香/甜香）、吲哚（樟脑香）、茶香螺烷（蜂蜜味）、β-大马士酮（煮苹果味）、茉莉酮（花香）、α-柏木烯（松针味/甜香）、α-紫罗兰酮（花香/紫罗兰香）、β-二氢紫罗兰酮（花香/紫罗兰香）、β-紫罗兰酮（花香/紫罗兰香）、香叶醇（玫瑰香/柑橘味）、香叶基丙酮（青草香）和2，4-二叔丁基苯酚（酚香）。3 个茶样中，香气强度最高的为2，3-辛二酮（奶香）、月桂烯（柑橘香/花香）、（E，E）-2，4-庚二烯醛（花香）、苯甲醛（杏仁味）、芳樟醇（柑橘香/花香）、二氢芳樟醇（柠檬味/甜香）、香叶醇（玫瑰香/柑橘味）、柠檬烯（柑橘味）、别罗勒烯（罗勒草香）、己醇（青草味/杏仁味）、β-大马士酮（煮苹果味）、茉莉酮（花香）和β-紫罗酮（花香），其香气强度在某一个样品中≥2.5，上述化合物对滇绿茶的特征香气品质具有重要贡献。

图4 3种滇绿茶中共同的香气物质种类和数量分布Fig.4 The type and amount distributions of the aroma compounds in all the three Dian green teas

表2 3个滇绿茶样品中香气物质的GC-MS/O分析结果Table 2 GC-MS/O analysis results of aroma compounds of in 3 Dian green tea samples

（续表2）

2.4 3种典型滇绿茶中香气物质的相对含量

由3种典型滇绿茶中香气物质的相对定量分析结果（见表3）可知，醛类化合物虽然不是最多，但含量普遍较高。分子量低的脂肪醛（碳个数少于10）含量多大于0.2%，如己醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、癸醛、正戊醛等；
芳香醛中苯甲醛的含量较高，平均相对含量达到0.267%，苯乙醛的含量较低；
环烯醛中β-环柠檬醛具有较高含量（0.109%）。然而，烯醛类化合物的相对含量在滇绿茶的香气成分中普遍不高，例如（E）-4-庚烯醛和（E）-2-己烯醛的平均含量为0.011%～0.013%。酮类化合物的相对含量在滇绿茶的香气成分中普遍较高，相对含量大于0.1%的化合物为4-甲基-3-戊烯-2-酮、β-紫罗兰酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、2，2，6-三甲基环己酮。醇类化合物相对含量较高的成分主要为二氢芳樟醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇和1-戊醇。杂环类化合物中，N-乙基吡啶、茶吡咯、2-乙基呋喃、吲哚和2-甲基-4-甲氧基苯胺的含量相对较高，其平均含量分别为0.820%、0.246%、0.149%、0.070%和0.070%。滇绿茶中酯类化合物的种类较少，除水杨酸甲酯（0.166%）外，其他酯类化合物的含量普遍较低。此外，在滇绿茶中仅检测到1 种内酯类化合物二氢猕猴桃内酯，且其含量不高。滇绿茶中烃类化合物最多，但平均相对含量均不高。其中芳香烃类化合物中间伞花烃的平均相对含量最高，其次是脂肪族烯烃中的柠檬烯。

表3 3个滇绿茶样品中香气物质的相对含量Table 3 The relative contents of aroma compounds in 3 Dian green tea samples

结合表2 和表3 的结果分析发现，在41 种较高含量（＞ 0.05%）的香气物质中，醇类、醛类、酮类、酯类等具有较好的香气属性，对滇绿茶的香气品质形成起着直接贡献作用。醇类化合物通常呈现愉悦的花果香气。尤其烯醇类化合物，例如芳樟醇、二氢芳樟醇、香叶醇等呈现花果香，是影响茶叶香气品质的重要组成，也是多种绿茶的关键香气成分［3，16］；
1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇则具有特征的蘑菇和泥土味，属不愉悦气味，通常在绿茶中含量较低。然而其在滇绿茶中相对含量较高，说明需进一步选择适制滇绿茶的茶树品种和工艺参数，以减少1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇的含量，提高香气品质。醛类化合物与形成茶叶香气和各种特异香气风格有密切关系［11］，其在滇绿茶香气组成中的含量比例较高。芳香醛如苯甲醛主要呈现杏仁味。而脂肪醛种类较多，主要呈现清香和花香味。其中，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛等低沸点醛具有麦芽的清香，是由亮氨酸和异亮氨酸通过Strecker降解反应形成［17］。己醛是绿茶中重要的新茶香物质，是很多绿茶清香的重要来源［18］。酯类物质大多呈现浓烈的果香，然而茶叶中常见的水杨酸甲酯呈现强烈的清凉感［3］，对滇绿茶香气品质具有突出贡献作用。酮类化合物是滇绿茶中另一类主要香气成分，香气特征与其结构关系密切。例如直链酮6-甲基-5-庚烯-2-酮呈现明显的烘烤香，带弥散的爆米花香，是茶叶烘烤香形成的重要因子［12，14］。而呈现紫罗兰香的环状酮β-紫罗兰酮由于其在水中极低的香气阈值（0.021 µg/L）而成为多种茶类的特征性成分，并且它可与红茶中的非挥发性物质发生协同作用，促进红茶产生甜味，是红茶中的典型甜味增强剂［19］。此外，二甲基硫醚是绿茶中重要的头香物质，呈现煮玉米的清香，其在水中的香气阈值仅为0.3 µg/L。研究表明S-甲基蛋氨酸盐作为二甲基硫醚的前体物质，在绿茶干燥和冲泡过程中发生剧烈热降解反应，产生大量二甲基硫醚。而萎凋和揉捻过程中S-甲基蛋氨酸盐的含量持续增加，为后续生成二甲基硫醚积累了大量前体物质［20］。值得一提的是，虽然部分物质在滇绿茶香气中的含量不高，但它们在水中的香气阈值较低，因此在低浓度下也能表现出显著的香气。如呈煮苹果味的β-大马士酮的香气阈值仅为0.006 µg/L，散发浓郁的油脂香和鱼油香的（E）-4-庚烯醛的香气阈值仅为0.008 7 µg/L，两者却是绿茶的特征性成分［8］。另外，滇绿茶中部分相对含量平均值高于0.05%的杂环类化合物（如呈茶香的茶吡咯；
散发樟脑香的吲哚，阈值为11 µg/L；
呈现塑料和皮革味的2-乙基呋喃，阈值为17 µg/L）可能对滇绿茶的香气品质有一定贡献。

综合传统感官审评、定量描述性分析、GC-O 嗅闻以及相对定量分析结果，滇绿茶的关键香气成分包括呈花果香的芳樟醇、二氢芳樟醇、香叶醇、β-紫罗兰酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、香叶基丙酮、月桂烯、茉莉酮、柠檬烯和β-大马士酮，呈清香的二甲基硫醚、3-甲基丁醛、别罗勒烯、己醇和水杨酸甲酯，呈奶香的2，3-辛二酮，呈杏仁味的苯甲醛以及呈烘烤香的6-甲基-5-庚烯-2-酮。

本研究采用HS-SPME/GC-MS/O 技术分析了滇绿茶的香气成分，通过总离子流图及色谱峰对比，完成了包括脂肪烃和芳香烃、醇、醛、酮、酯、酚、杂环化合物、含硫化合物等在内的83种共有化合物的定性及相对定量分析。含量较高以及香气强度较高的化合物有二甲基硫醚、3-甲基丁醛、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、柠檬烯、芳樟醇、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、二氢芳樟醇、水杨酸甲酯等，主要呈现玉米香、青草香、麦芽香、柑橘香和花香等香气特点，对滇绿茶的花果香、甜香和清香等愉悦的香气属性具有重要贡献作用，是滇绿茶的关键香气成分。相对含量不高的低阈值化合物（如吲哚、茉莉酮、香叶醇、β-大马士酮、烯醛类化合物等）也可能是形成滇绿茶的关键香气物质，今后研究将重点关注这部分化合物。

茶叶香气的形成和挥发受茶树品种、生长环境和加工过程等多种因素的影响［2，21-22］。不同茶树品种中与茶叶香气形成有关的氨基酸、糖类、蛋白质及多酚等含量不同［23］；
不同生长环境的茶叶的香气存在差异，如高山茶园在高海拔条件下，蛋白质、氨基酸以及芳香物质的形成较多，而糖类含量较少［23］；
用同一种鲜叶原料制作的名优绿茶的香气成分含量因制作工艺不同而表现出明显的香型差异［18，24］。干燥后，茶叶中低沸点的具有青草气味的醇类和醛类物质继续减少，而有利于绿茶香气的具有清香或花香的酯类等成分的含量大幅增加［18］。在贮藏过程中，酯类物质逐渐水解，使茶叶产生陈气；
芳香物质中某些烃基化合物与氨基酸进行缩合变化，使具有鲜爽感的主要香气成分的含量降低，导致香气“滞钝”而缺乏鲜爽感［25-26］。本研究对26 种滇绿茶进行总离子流图对比，发现滇绿茶挥发性成分的种类和含量差异较大，后续研究将重点区分香气成分的可能影响因素（如茶树品种、采摘嫩度、采摘季节、加工工艺及参数等），以期为滇绿茶实际生产提供理论指导。

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