类风湿关节炎中医实验动物模型研究进展*

张文瑞，杨爽，吕新亮

内蒙古自治区中医医院风湿科，内蒙古 呼和浩特 010000

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性、对称性多关节炎为主要表现的进行性、侵袭性的自身免疫性疾病［1-3］。RA导致的滑膜炎持久反复发作，破坏关节软骨及骨质，最终导致关节畸形及功能障碍，因此该病具有很高的致畸率［4-6］。RA属于中医“痹证”“鹤膝风”等范畴，中医药治疗具有辨证论治、审证求因的特点，以其多途径、多靶点、整合效应的优势在RA的治疗中发挥着日益重要的作用［7-11］，但中医药治疗RA多缺乏明确的作用机制。动物模型作为实验研究的基出，对开展疾病的发病机制及治疗机制研究有着重要的意义。人体和疾病存在复杂性和不可控性，临床证候研究中存在许多未知因素。若要开展证候形成机制及中药作用机制的科学性研究，就必须构建具有中医属性的动物模型。本文拟对近年RA中医证型动物模型进行综述，以期为未来更全面的中医证型动物模型提供参考。

徐成林等［12］结合新疆高寒地区的特点，模拟自然界的风寒湿环境，对健康家兔的后肢进行风寒湿痹证造模。造模选择在冬季进行，将家兔后腿放入环境海绵的造模箱孔内，打开喷雾、水源，调节室温控制在（7±2）℃；
相对湿度为95%，风力5～6级，每天持续刺激造模部位5 h，持续刺激5天。造模后关节组织的滑膜细胞增生活跃、胞浆内含大量溶酶体、滑膜下有嗜酸性细胞浸润、成纤维细胞活跃，与未造模的前腿有着显著差异。但该实验建立的动物模型为单纯性关节炎模型，与人RA表现、客观指标及病理变化存在一定的差异。

模拟自然环境进行造模只能使模型在病因学上与人类相似，如何使模型的发病机制、发病过程、临床症状、免疫特点与人类相似是建立RA中医动物模型需解决的关键问题。病证结合的动物模型既有西医疾病的诊断特征，又有中医证候的病因病机及不同表现，成为目前RA中医动物模型建立的首选方法［13-14］。RA国际中医临床指南［15］及RA病证结合诊疗指南［16］将RA辨证为风湿痹阻证、寒湿痹阻证、湿热痹阻证、痰瘀痹阻证、瘀血阻络证、气血两虚证、肝肾不足证、气阴两虚证。目前多见的造模证型也是围绕以上证型开展。而RA模型的建立多选择佐剂型关节炎模型（adjuvant arthritis，AA）及胶原型关节炎模型（collageninduced arthritis，CIA）［17-20］。

3.1 AA模型 AA大鼠造模方法是将含减毒卡介苗的弗氏佐剂注射至足趾关节皮下，导致局部免疫炎症反应，形成免疫复合物，刺激T细胞激活、分化、增殖，模拟RA免疫炎症病理变化反应过程，发挥特异性免疫反应效应。AA模型发病过程同时涉及细胞免疫反应及体液免疫反应，累及部位不仅限于关节，同时可见心、肺、免疫器官等多系统受累表现，临床、病理等方面与RA极为相似［21-23］。刘磊等［24］研究发现，AA大鼠同时也存在血小板病变。刘琪等［25］研究发现，AA模型同时受到性别的影响，雌性SD大鼠体质量下降程度高于雄性SD大鼠；
而踝关节病理评分、脾脏评分均高于雄鼠。

3.2 ClA模型 1977年Trentham等首先建立了Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型［26］。该模型的两个重要特征是破坏耐受性及产生自身和胶原自身抗体，因其在免疫机制、关节病理改变、临床表现和实验室指标上与人类RA最为相似［27-28］，CIA成为RA研究的金标准［29-30］。CIA模型还具有操作简单、病变持续时间较长、滑膜增生及软骨破坏等继发性病变特征明显、造模成功率高等特点，因此CIA在科研实验中被广泛应用［31-32］。

CIA模型常用牛Ⅱ型胶原蛋白（calf Ⅱ collagen，CⅡ）分别与不完全弗氏佐剂（incomplete Freund"s adjuvant，IFA）或完全弗氏佐剂混合（complete Freund"s adjuvant，CFA）乳化以制备［33-34］。笔者通过查阅文献发现，完全弗氏佐剂应用更为广泛。但郭帅［35］比较CⅡ联合两种佐剂制备CIA大鼠模型发现，CⅡ+IFA模型不良反应更小，更适合作为大量复制的CIA动物模型。制备CIA模型时需先将CⅡ与等体积的IFA或CFA在4 ℃无菌条件下充分混匀乳化，配制溶液浓度为1 g/L（即1 mL溶剂含有CⅡ 1 mg），随后对造模动物进行皮内免疫注射，选择多个位置多次少量注射，总量约为200 μL，此为初次免疫；
7天后以同样方案于不同部位100 μL加强免疫1次［36］。

3.3 病证结合模型

3.3.1 风、寒、湿痹病证结合动物模型 《素问·痹论》篇云：“痹之安生？风、寒、湿三气杂至，合而为痹也。”风、寒、湿是导致痹证的重要因素。吕爱平等［37］采用冷水游泳联合Ⅱ型胶原建立风寒湿痹大鼠模型。首先将大鼠放入15 ℃的冷水中游泳7 min，每日1次，连续7天，随后取1.5 mg/mL的Ⅱ型胶原粗提取物的乳化混合物0.125 mL于大鼠尾部、踝部多处皮内注射，每只动物注射1次，含Ⅱ型胶原粗提取物约0.18 mg。造模动物病理变化呈滑膜受损期和软骨损伤期，45天后造模关节病理可见大量成纤维细胞，甚至出现软骨下骨细胞变性、坏死。

肖长虹等［38］认为，吕氏造模方法仅有炎症浸润程度的病理观察，而未对临床表现的差异进行报道。其用0.1 mL冰醋溶解2 mg/mL的Ⅱ型胶原，与等体积的IFA混合后再加入3 mg/mL卡介苗研磨、乳化成胶原，每只大鼠于尾部、颈背部皮内多点注射胶原共500 μg；
7天后再于尾根部及背部皮内注射胶原200 μg进行加强免疫。大鼠从接受第1次胶原注射开始，每天于造模箱中接受风、寒、湿刺激1次，每次1 h，刺激条件为风速18 m/s，相对湿度100%，温度7～10 ℃，共刺激9天。第7～9天时每只鼠双后肢踝关节以下均匀涂抹纤维素糊各30 μg（含葡萄球菌肠毒素B 5 μg），即每只鼠每次外涂SEB 10 μg，再进行风、寒、湿刺激。造模后模型组炎症积分显著增加，炎症关节表面温度显著降低，与中医证型的临床表现类似。

魏艳霞［39］在前期研究中制作了规范、可控的风、寒、湿造模装置——人工智能气候箱，并明确优化了风、寒、湿刺激条件及刺激时间。其选用SPF级雄性大鼠放入特制的人工气候造模箱（上海汗诺PRX-150B）中接受风、寒、湿刺激14天，每天1次，每次4 h，条件为风速5 m/s，湿度90%～95%，温度0～2 ℃。第15天大鼠尾根部皮下注射0.1 mL含200 μg热灭活菌结核杆菌（Mtb）的CFA诱导佐剂型关节炎（adjuvantinduced arthritis，AIA）模型，继续风寒湿刺激30天。造模成功后大鼠出现精神萎靡、畏寒喜暖、饮食饮水量减少、大便质稀，耳缘有风湿结节、舌质紫黯、舌底络脉曲张、尾根部溃烂等。与RA的AIA大鼠模型相比，受风、寒、湿刺激的大鼠足肿胀容积明显增加，平均发病时间提前，病理程度明显加重，实验后期残疾率明显上升。

朱兴旺［40］认为，目前风、寒、湿痹模型多集中在模型与人类RA病理过程、寒痹证的相似相符程度及中药方证研究上，而较少关注风、寒、湿等外界环境的致病实质及其激发、加剧关节炎的致病机制。因此朱兴旺的研究以CIA大鼠为基出，探讨风、寒、湿对中医证候的影响及致病实质。实验选择SPF级SD大鼠，每只大鼠于尾根部注射0.2 mL鸡Ⅱ型胶原+CFA乳剂做首次免疫；
第7天加强免疫。于加强免疫后接受人工气候箱风、寒、湿干预，条件为：温度8 ℃，湿度90%，风速5 m/s，每天2次，每次2 h，共64 h。造模后大鼠AI值于首次免疫后28天左右时达到峰值，红肿消退率与普通模型组无差异。风、寒、湿组大鼠踝关节基本无组织肿胀，有较明显的骨侵袭，但仍有关节间隙。朱兴旺［40］认为，受风、寒、湿环境刺激的CIA大鼠未能模拟出人类RA寒痹证型的证候特点。

3.3.2 风湿热痹病证结合动物模型 肖长虹等［38］建造风、湿、热痹病证结合动物模型与风、寒、湿痹模型相似，即接受胶原免疫刺激后在造模箱中接受风湿热造模刺激。条件为：风速18 m/s，相对湿度100%，温度36～38 ℃，刺激9天。7～9天时同样予纤维素糊各30 μg（含葡萄球菌肠毒素B5 μg）于双后肢踝关节以下，再予风、湿、热刺激。造模结束后模型动物炎症关节99mTc含量显著增加，炎症关节表面温度升高。

梁江洪等［41］使用0.1 mL/L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型胶原蛋白，配置成4 mg/L的溶液，再按1∶1体积与弗氏不完全佐剂混合、振荡并充分乳化，制成CⅡ乳剂。选择SPF级雌性Wistar大鼠，于颈、背、尾部多点皮内注射CⅡ乳剂0.25 mL致炎，并于7天后按上述方法再次免疫。大鼠于首次免疫后开始在自制造模箱内接受风湿热刺激，每天1 h，条件为：风速5 m/s，相对湿度90%，温度（37±1）℃。造模后大鼠关节表面温差显著增高、关节炎症指数及TNF-α、IL-1β显著升高。

朱兴旺等［42］使用SPF级SD大鼠建立风、湿、热痹模型，每只大鼠于尾根部注射0.2 mL鸡Ⅱ型胶原+CFA乳剂做首次免疫；
第7天加强免疫。于加强免疫后接受人工气候箱风、寒、湿干预，条件为：温度36 ℃，湿度90%，风速5 m/s，每天2次，每次2 h，共64 h。造模结束后大鼠AI值于首次免疫后19～21天时达到峰值，最高为11分，峰值可维持10天左右，红肿消退率最慢，至观察期结束时仍能观察到后肢关节肿胀，AI约为4分。且踝关节有轻度软组织肿胀、严重骨侵袭，关节基本融合，评分较普通模型组显著增高。该研究结果表明，较长时间的风、湿、热刺激能使CIA大鼠关节红肿程度加重，并使其炎症峰值提前、持续时间延长，结束环境刺激后关节炎症状缓慢消退。同时CIA大鼠的基出属性为热，风、湿、热刺激能加重热证表现，与临床上热痹“遇热加重，遇寒减轻”说法一致，且风湿热的刺激可以模拟人类RA热痹发病过程，其致病机理可能与上调HSP-70有关。

3.3.3 内生痰湿病证结合动物模型 周游［43］选择SPF级雄性DBA/1小鼠，先予高脂饲料连续喂养4周，然后在小鼠尾根部皮下多点注射0.2 mg/只Ⅱ型胶原溶液与等体积CFA混合乳化的CIA佐剂。首次免疫当天记为第1天，第21天以0.1 mg/只剂量于小鼠尾根部皮下多点注射激发免疫。造模后痰湿CIA小鼠身体剧烈颤抖、眯眼迟钝不喜动、弓背、大便质稀。与正常组相比，痰湿CIA小鼠肥胖指数差异明显，关节AI指数增长迅速；
关节组织病理可见关节面粗糙、大量的炎性细胞浸润与融合，血管翳布满关节间隙。

3.3.4 痰瘀痹阻病证结合动物模型 唐先平［44］使用雌性SPF级SD大鼠建立痰瘀痹阻证动物模型。首先取无水羊毛脂40 mL、液体石蜡60 mL高压消毒后按8 mg/mL加入灭活卡介苗，制成完全弗氏佐剂（complete Freund"s adjuvant，FCA）。第1周大鼠单日喂饲甘蓝，10～15 g/只，双日灌喂精炼猪油4 mL/只，第8天于每只大鼠右后跖皮下注射0.1 mLFCA，每只动物只注射1次。其后继续予高脂饲料喂养。造模后大鼠出现体毛无光泽、畏寒蜷缩、懒动、进食减少、时有溏便，舌根部出现厚腻苔和舌质紫暗，并伴有足跖肿胀、近端趾间关节及其他肢体关节肿胀，耳部及尾根部出现红斑及/或结节。痰瘀痹阻证大鼠出现t-PA上升、PAI下降的趋势，证明该模型影响到血凝纤溶系统，出现高凝（即血瘀）状态。

3.3.5 血瘀证病证结合动物模型 李茜等［45］认为，RA皮下结节或瘀斑是久病瘀阻经络，脉络不通之象，故以雌性SD大鼠在Ⅱ型胶原诱导的CIA关节模型的基出上，结合长期小剂量注射盐酸肾上腺素和4 ℃冷水应激的方法，建立RA血瘀证动物模型。首先将一定量Ⅱ型胶原蛋白溶解于0.1 mol/L的乙酸中，使其浓度为1 g/L，再与等体积的CFA溶液混合并完全乳化。初次免疫时将此乳化剂按0.75 mL/kg注射于模型组大鼠右侧膝关节腔、足跖皮内、背部及尾部，同时以肾上腺素注射液0.1 mg/kg皮下注射大鼠，2 h后置于4 ℃冷水中游泳5 min，连续14天，初次免疫后14天再按0.5 mL/kg剂量再次注射乳化剂于大鼠背部及尾根部皮下以加强免疫。造模后大鼠日渐畏寒喜暖、蜷缩少动、尾爪紫暗、膝关节、足趾、踝关节红肿、屈伸不利、活动受限，舌质紫暗或见瘀点。造模第4天足趾即出现肿胀，第24天达到高峰，伴血清RF、TNF-α、TX-A2浓度增高；
全血黏度及血浆黏度均高于正常组；
膝关节软骨表面不光整，浅表层可见增生纤维化，部分可见裂纹；
软骨全层细胞减少，细胞排列紊乱，分布不均，部分细胞核坏死，部分软骨陷窝消失；
软骨基质染色浅且不均匀；
潮线模糊、不规则，附近有血管穿过，且软骨组织Mankin"s评分较正常组增高。

3.3.6 脾虚证病证结合动物模型 杜中平等［46］采用腹腔注射利血平联合CIA建立RA脾虚证动物模型。选择SPF级SD大鼠，给予利血平0.5 mg/（kg·d）腹腔注射［47］，14天后于尾根部皮下注射乳化后的混合物（2 mg/mL牛Ⅱ型胶原加入等容积不完全弗氏佐剂中，使牛Ⅱ型胶原终浓度为1 mg/mL）0.2 mL/只，即 200 μg牛Ⅱ型胶原/只，7天后按0.1 mL/只，即100 μg牛Ⅱ型胶原/只，于尾根部皮下加强免疫1次。造模后大鼠出现精神萎靡，眯眼，背毛枯疏无光泽，弓背蜷缩，踝关节红肿，倦怠、懒动，喜聚堆，饮食减少，体质量下降，稀便。大鼠回肠病理示小肠绒毛排列紊乱，数量减少，长短、宽窄不一，被覆上皮可见有多量杯状细胞，肠腔内可见大量剥脱、退变、坏死的绒毛碎片。坏死组织内见有炎性细胞浸润，肠腔内可见剥脱。与正常对照组相比，造模组大鼠T细胞增殖能力和LPS刺激后B细胞增殖能力明显升高，外周血CD4/CD8明显升高、CD3+细胞、CD4+细胞明显下降，关节肿胀度与关节病理损伤程度加重，抗Ⅱ型胶原抗体、IL-10水平升高。因此该模型既有明显的脾虚症状，又有RA的特征。

3.3.7 肾虚证病证结合动物模型 赵宏艳等［48］建立羟基脲致肾虚RA大鼠模型及去势致肾虚RA大鼠模型。具体如下：去势肾虚组选择SPF级SD大鼠，摘除双侧卵巢，术后28天于尾根部皮下注射乳化后的混合物（2 mg/mL牛Ⅱ型胶原加入等容积不完全弗氏佐剂中，使牛Ⅱ型胶原终浓度为1 mg/mL）0.2 mL/只，即200 μg牛Ⅱ型胶原/只，7天后按0.1 mL/只，即100 μg牛Ⅱ型胶原/只，于尾根部皮下加强免疫1次。羟基脲肾虚模型予羟基脲375 mg/（kg·d）灌胃，灌胃17天后按上述方法进行CIA模型复制。两种造模方法均可使大鼠出现关节红肿、变形、活动减少，弓背蜷缩、体毛枯疏、扎堆及饮食减少、肛周污秽等，与人类肾虚证候相似，且能升高大鼠关节肿胀度，降低IL-6含量、升高IL-10及INF-γ含量，但去势组INF-γ含量高于羟基脲组。因此赵宏艳等［48］认为去势法建立的肾虚RA模型优于羟基脲肾虚模型。

目前尚无文献对RA气血两虚证、肝肾不足证、气阴两虚证的造模方法进行详细论述。

RA是一种易致残的自身免疫性疾病，关节反复疼痛及功能障碍不仅影响患者的生理健康，还会影响患者的心理健康［49-50］。研究表明，RA患者抑郁症的发病率为32.7%～55.4%，但只有11.7%的患者接受了抗抑郁治疗［51-52］。我国RA伴发抑郁症的发病率高达44.7%，高于全球平均水平［53-54］。RA伴发抑郁症发病机制尚不明确，因此建立一个可靠的动物模型将对研究RA伴发抑郁症起到重要的作用。

郑琴［55］认为，RA伴发抑郁症的病机为肝肾亏虚，以肾虚为要，同时伴有瘀阻脉络，因此采用胶原诱导联合慢性轻度不可预见性应激复合孤养制备RA伴发抑郁症大鼠模型。首先制备CIA大鼠模型。将牛Ⅱ型胶原溶解于乙酸，此溶液与等量的CFA混合，制备成牛Ⅱ型胶原终浓度为1 mg/mL的混合物，并将其充分乳化，取此混合物于大鼠左足底皮下按0.1 mL/只注射，共含Ⅱ型胶原100 ug/只。其后将大鼠单笼孤养饲养7天后，再予21天的慢性不可预知的温和应激，包括：将大鼠予以夹尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、45 ℃环境5 min、昼夜颠倒24 h、水平振荡30 min（160次/min）、4 ℃冰水游泳5 min的7种方法刺激。大鼠每天接受1种刺激，连续3周。造模后大鼠呆滞少动、饮食减少、体质量明显减轻。大鼠关节肿胀度、关节炎症指数明显高于正常组。大鼠踝关节滑膜形态学见滑膜组织充血、水肿，滑膜细胞排列不规则，可见炎性细胞浸润及纤维组织增生，有血管翳形成，有软骨和骨质破坏模型组滑膜组织高度增生、充血、水肿，有丰富的血管翳形成，细胞排列不规则，可见大量炎性细胞浸润。且伴有5-HT、NA、DA、5-HIAA的降低，证明下丘脑单胺类神经递质的下降。

石磊［56］认为，细胞因子IL-27、IL-17和IL-10可能在RA伴抑郁症发病中起了重要的作用［57-58］。同样他采取在CIA大鼠模型基出上联合慢性不可预知温和刺激抑郁症模型建立RA共病抑郁症复合模型，并参考改进Fu［59］的CIA造模方法，雌性Wistar大鼠尾根部皮下注射100 mg含4 mg/mL变性分枝杆菌的牛Ⅱ型胶原（用等体积的CFA充分乳化）并压迫使乳化液充分吸收。在CIA诱导关节炎模型基出上，将大鼠单笼孤养7天后，再给予21天慢性不可预知的温和刺激。石磊［56］建立抑郁症的慢性不可预知温和刺激方法参考改进WANG等［60］的方法：夹尾1 min，禁水、禁食24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45°倾斜鼠笼24 h，水平震荡20 min（频率80次/分），闪光刺激（频率3次/分），电击（电流强度1.0 mA，频率1次/分）。大鼠每天接受1种刺激，7天为1个周期，连续刺激3个周期。造模后4天大鼠出现始发于后足的对称性、多关节红肿，后期可见关节强直、功能障碍，并伴有蜷缩少动，毛发粗糙、无光泽，胆小易惊，体质量减轻，同时出现饮用糖水量减少、旷野试验刺激水平评分下降，IL-27、IL-17和IL-10水平升高等表现。

由目前研究可见，目前RA中医动物模型研究热点集中在病证结合动物模型，尤其是风寒湿热痹证模型［61-63］，但这些动物模型多是单纯的西医的“病”及中医的“证”的叠加，模型制作方法简单，并未从本质上探索病和证的关系，也未考虑到遗传因素及体质因素对中医证候的影响。且对于造模动物的选择各家也各执一词，虽多选择大鼠CIA模型，但也有对雌雄大鼠的不同选择体现激素和干预条件耐受性的不同，缺乏统一、明确的标准。

由于RA的复杂性及中医证型的多样性，动物模型仅能代表病证的某些方面；
随着研究目的的不同，所需的动物模型也不尽相同。因此还应该进行进一步的探索，以期能建立真正符合中医证型、体现中医精髓的RA中医动物模型。

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