高品涵, 薛 薇, 李 婷, 张新霞,王 莉, 王俊仁, 陈正行
(粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心1,无锡 214122)
(江南大学食品学院2,无锡 214122)
(江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心3,无锡 214122)
(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室4,无锡 214122)
(江苏省农垦农业发展股份有限公司现代农业研究院5,南京 210019)
大米是世界上一半以上人口的主要食物,主要成分为淀粉,并且大米在传统意义上是一种高血糖生成指数(glycemic index, GI)的食物。当GI值在70以上时,为高GI食物;GI值在55~70之间时,为中等GI食物;GI值在55以下时,为低GI食物。长期食用高GI食物会导致某些慢性疾病的发病率增加,如Ⅱ型糖尿病、肥胖、高脂血症和心血管疾病[1]。近年来,随着农业育种科学的发展,为满足特殊人群的需要,科研人员培育了许多低GI值的大米品种,但是其产生低GI值的机理并不明确。
谷物淀粉消化率会受到非淀粉成分的影响,目前的研究表明,大米的蛋白质、脂质和少量膳食纤维都会影响淀粉的消化特性。Ye等[2]的研究表明,内源性脂质和蛋白质可以在淀粉颗粒形成屏障包裹,抑制淀粉颗粒的膨胀,限制淀粉酶对淀粉分子的接触,从而延缓大米淀粉的酶解。Li等[3]研究发现在熟米粉中蛋白质的物理屏障对大米淀粉消化率的影响较大,在生米粉中蛋白质的化学作用对于大米淀粉消化率的影响更为显著。目前有关内源性非淀粉对大米淀粉消化特性的研究以单一品种为研究对象,对于不同GI值的大米品种,内源性非淀粉物质对于淀粉消化性的影响强弱差异及其机理尚不明确。
Doongara是一种国际上商品化的低GI大米品种[4],并经过多次血糖实验验证[5]。本实验以2种GI值差异显著的大米,即Doongara和一种常见高GI大米南粳46作为研究对象,探究内源性非淀粉物质对于不同品种米粉的体外消化率、理化性质及微观结构的影响,为开发缓慢消化、血糖反应水平较低的米制品提供参考。
南粳46,Doongara,碱性蛋白酶(200 U/mg)和纤维素酶(400 U/mg),猪胰腺α淀粉酶(12 U/mg),糖化酶(3 260 U/mL),D-葡萄糖检测试剂盒,其他化学试剂均为分析纯。
LXJ-ⅡB型离心机,SH-1000 全自动定量绘图酶标仪,101FX-1电热恒温鼓风干燥箱,HZT-B5000电子天平,MVS-1旋涡混合器,SHZ-82数显水浴恒温振荡器,DZKW-S-6电热恒温水浴锅,FA1004电子分析天平,SU8100 冷场发射扫描电子显微镜,RVA 4500 型快速黏度分析仪,DSC3 型差示扫描量热仪,D2 PHASER 型 X 射线衍射仪,IS10型傅里叶红外光谱仪。
1.3.1 基本指标以及血糖生成指数的测定
水分、淀粉、蛋白质、脂质、膳食纤维、直链淀粉含量的测定分别按照GB 5009.3—2016、GB 5009.9—2016、GB 5009.5—2016、GB 5009.6—2016、GB 5009.88—2014、GB/T 15683—2008。
Doongara和南粳46的血糖生成指数的测定按照WS/T 652—2019。
1.3.2 内源性非淀粉物质的脱除
取每种大米150 g,用粉碎机研磨10 min,过100目筛,得到米粉,将南粳46和Doongara所得米粉分别标记为HR和LR。
脱除非淀粉成分的方法参考Ye等[2]、赵九永等[6]和Yang等[7]描述的方法并适当修改。
用石油醚萃取法去除米粉中的脂质。将120 g米粉与500 mL石油醚混合,在室温下连续搅拌过夜,过滤得到固体残渣,然后重复2次,得到脱脂米粉,分别记为HR-l和LR-l。
采用碱性蛋白酶水解法去除米粉中的蛋白质。将120 g米粉放入烧杯中,加入800 mL 120 U/mL的碱性蛋白酶溶液。在45 ℃水浴中水解2 h,持续搅拌,4 000 r/min离心10 min得到沉淀。重复此步骤,固体残渣用蒸馏水冲洗至中性pH,最后将脱蛋白米粉干燥,分别标记为HR-p和LR-p。
用酶解法去除米粉中的膳食纤维。将120 g米粉放入烧杯中,加入800 mL 80 U/mL的纤维素酶溶液。在45 ℃水浴中水解2 h,持续搅拌,4 000 r/min离心10 min。重复此步骤,将固体残渣用蒸馏水冲洗至中性pH,最后将脱膳食纤维米粉干燥,分别标记为HR-c和LR-c。
通过碱提法获得大米淀粉,将米粉置于去离子水浸泡过夜,用纱布过滤,滤掉较大颗粒。配置0.2%质量分数NaOH溶液,调节米粉乳液pH在10左右,混合、搅拌,浸泡5 h,收集下层沉淀,反复水洗,直至调pH为7,4 000 r/min离心20 min,刮去表层黄色物质,取白色沉淀物,干燥,粉碎过100目筛,得到大米淀粉,分别标记为HRS和LRS。
1.3.3 体外消化特性测定方法
淀粉体外消化是参照Miao等[8]所采用的方法并适当修改。称取0.022 5 g胰α-淀粉酶溶解在10 mL 0.02 mol/mL醋酸钠缓冲液中,再加入20 μL淀粉葡萄糖苷酶,磁力搅拌30 min。称取200 mg待测样品与10 mL浓度为0.02 mol/mL醋酸钠缓冲液混合,沸水浴30 min,37 ℃平衡10 min,然后加入10 mL胰α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶混合液。在消化后10、20、30、60、90、120、180 min吸取上清液0.1 mL与0.9 mL无水乙醇混合以灭活酶,并在10 000r/min下离心5min。随后,使用D-葡萄糖检测试剂盒测量孵育混合物的葡萄糖浓度。淀粉消化率由式(1)计算。
淀粉消化率=Gt×0.9 /TS×100%
(1)
式中:Gt为t(0~180 min)时间内释放的葡萄糖;TS为样品的总淀粉含量。
快速消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量由式(2)~式(4)计算。
RDS =(G20-G0)×0.9 /TS×100%
(2)
SDS =(G120-G20)×0.9/TS×100%
(3)
RS = [TS-(RDS+ SDS)]×0.9 /TS×100%
(4)
式中:G0为水解前淀粉中的葡萄糖含量/mg;G20为20 min内释放的葡萄糖/mg;G120为120 min内释放的葡萄糖/mg。
淀粉消化动力学模型为一级反应[9],见式(5),采用非线性拟合分析k和C∞值。
Ct=C∞[1-ekt]
(5)
式中:Ct为消化时间t(min)时消化淀粉的分数;C∞为反应终点消化淀粉的估计量;k为消化速率/min-1。
1.3.4 膨胀力与溶解度的测定
将0.2 g样品分散在10 mL蒸馏水中配制悬液,分别在55、75、95 ℃下搅拌加热30 min。然后,在冰浴中快速冷却,在4 000 r/min下离心15 min。将上清液置于105 ℃烘箱,烘干直至恒重,之后立即称沉淀物质量。溶解度和膨胀力计算见式(6)和式(7):
溶解度=m2/m1×100%
(6)
膨胀力=m3/[m1×(100-溶解度)] ×100%
(7)
式中:m1为样品的干质量/mg;m2为上清液中可溶性物质的质量/mg;m3为沉淀物的质量/mg。
1.3.5 热力学特性的测定
使用差示扫描量热仪测定样品的热力学特性。精确称取3 mg样品与去离子水按1∶3的比例置于密封的铝锅中,在4 ℃下平衡过夜。然后在氮气下,以空锅为参考,以10 ℃/min的速率,在30~100 ℃范围内扫描平衡样品。使用热数据分析软件STARe Default DB V16.00,确定每次分析的起始温度(To)、峰值温度(Tp)、结论温度(Tc)和焓变(ΔH)。
1.3.6 X射线衍射扫描
使用X射线衍射仪测定样品的晶型和相对结晶度,按照Ahmad等[10]的方法,并适当修改。衍射条件:室温,铜靶电压40 kV,扫描速率为4(°)/min,步长为0.02°,扫描角度2θ为4° ~ 40°。
1.3.7 傅里叶变换红外光谱扫描
使用傅里叶变换红外光谱仪在4 000~400 cm-1范围内以4 cm-1的分辨率记录光谱,所有测试使用32次扫描。采用FTIR光谱仪自带的OMNIC 9软件进行短程有序度分析。对数据进行处理,将光谱转换为吸光度值,并进行自动基线校正和去卷积。半峰宽度和增强因子分别设置为52和1.9。去卷积后分别在1 045、1 022 cm-1处读取数值。
1.3.8 糊化特性的测定
称取3.0 g样品放入铝罐中,水质量分数为14%,加入蒸馏水,使总质量为28.0 g。每个样品在50 ℃下保温1 min,4.5 min内加热至95 ℃,95 ℃保温2.0 min,5.5 min内冷却至50 ℃,50 ℃保温2.0 min。
1.3.9 扫描电镜
取适量样品均匀分散在双面胶上,然后粘附于载物架上,置于扫描电镜下观察样品的表观形貌,加速电压为5.0 kV,放大倍数为2 000倍。
实验数据处理使用SPSS 25和Microsoft Excel 2016软件完成,绘图使用Origin 2017软件完成,其中消化动力学模型拟合使用Origin 2017软件非线性拟合BoxLucas1函数进行拟合,结果表示为平均值±标准偏差(n= 3),P<0.05表示为显著差异。
2种米的基本成分如表1所示,Doongara的直链淀粉含量显著高于南粳46,蛋白质含量略高于南粳46,其他基本成分的差异不显著。人体血糖实验结果表明,南粳46和Doongara的GI值分别为97和52,分别属于高GI和低GI食物,因此将南粳46和Doongara分别标记为HR 和LR。
表1 2种大米的基本成分质量分数以及血糖生成指数
经过不同处理的HR和LR样品的体外淀粉消化参数见表2。对于HR系列的样品,RDS、SDS、RS以及最终消化率的参数无显著差异,在消化速率上HR-p、HRS>HR-c>HR-l、HR。对于样品LR,去除脂质使样品的最终消化率降低了8.02%,而去除膳食纤维和蛋白质分别使淀粉的最终消化率升高了7.37%和13.28%,且蛋白质的影响大于膳食纤维。在淀粉组成上,脂质的去除对淀粉组成影响较小,蛋白质和膳食纤维的脱除使RS分别降低了11.37%和8.86%,但膳食纤维的脱除使RDS增加了9.95%。
表2 脱除内源性成分后的2种米粉体外消化参数
在HR中,内源性非淀粉成分对于淀粉体外消化的影响较小,在LR中,非淀粉成分对体外淀粉消化的影响显著。蛋白质和膳食纤维在体外对淀粉消化影响显著,但脂质影响不显著。蛋白质和膳食纤维去除导致样品水解速率增加的原因可能有:1)蛋白质和膳食纤维包裹淀粉,阻止淀粉酶与淀粉结合;2)蛋白质和膳食纤维部分结合淀粉酶,导致酶的消化可用性降低[11, 12]。脂质与直链淀粉形成淀粉-脂质复合物从而影响淀粉消化,然而,由于样品中脂质的含量很低,只能发挥有限的作用[13]。
膨胀力和溶解度可以反映淀粉颗粒与水分子相互作用的程度。当米粉在过量的水中加热时,淀粉颗粒膨胀,水分子通过氢键与暴露的羟基相连,导致直链淀粉浸出和支链淀粉分子膨胀,淀粉的晶体结构从有序逐渐变为无序[2]。图1表明,在55 ℃时,样品间的膨胀力无显著差异,随着温度的升高,米粉的膨胀力增大。75、95 ℃时HR的膨胀力均高于LR的膨胀力,去除脂质后膨胀力无明显变化。去除蛋白质和膳食纤维后,样品在95 ℃时的膨胀力显著提高,HR-p(17.83±0.30)g/g、HR-c(16.65±0.25)g/g样品的膨胀力高于LR-p(16.22±0.78)g/g、LR-c(13.44±0.27)g/g,这可能是因为蛋白质或膳食纤维的存在限制了淀粉与水结合的能力,将其去除使得淀粉与水的结合能力增加。同时,膨胀力的提高导致在消化过程中淀粉酶有更多的作用位点,使得LR-p、LR-c相较于LR有更高的消化速率。然而,去除蛋白质和膳食纤维后,75 ℃时体系的膨胀力均有所下降,LR-p、LR-c和HR-p、HR-c的膨胀力分都有所降低,这可能是因为蛋白质或膳食纤维存在两性基团,在糊化温度前与淀粉竞争吸附水分子。在55、75 ℃时,不同样品的溶解度无显著差异。在95 ℃时,样品的溶解度增加,这可能是由于温度升高后,淀粉的膨胀和溢出导致LR的溶解度(16.04±0.16)%显著高于HR的溶解度(9.19±0.43)%,但去除脂质、蛋白质和膳食纤维对米粉本身的溶解度没有显著差异。
图1 脱除内源性成分后的2种米粉膨胀力和溶解度
经过不同处理的HR和LR样品的热力学特性如表3所示。通过测定不同样品的起始温度(To)、峰值温度(Tp)和终值温度(Tc),探究了内源性非淀粉物质对于淀粉热力学特性的影响。结果表明,LR样品的To、Tp和Tc均高于HR,这说明LR较HR更难糊化。去除脂质后,2种米粉的热力学特性变化不明显,这与Ye等[2]之前得出的结论略有不同,可能是因为品种之间脂质含量不同。而蛋白质和膳食纤维的去除显著降低了2种米粉的Tp和Tc,去除蛋白质使HR和LR的Tp分别从(74.2±0.0)、(69.2±0.2)℃降低至(73.0±0.4)、(67.9±0.1)℃,虽然膳食纤维在米粉中的基本含量很低,但是膳食纤维的去除对淀粉糊化温度的影响显著大于蛋白质,峰值温度接近相对应的淀粉样品。从米粉中去除蛋白质和膳食纤维使淀粉更容易糊化,也使淀粉颗粒更容易膨胀。
表3 脱除内源性成分后的2种米粉热力学特性及有序度
经过不同处理的HR和LR样品的X射线衍射图如图2所示,所有样品的反射强度均集中在15°、17°、18°和23°左右,为A型淀粉晶体[14]。A型淀粉对于消化酶有更高的敏感性,是更易消化的,所以含有A型结晶淀粉的米粉通常表现出快速消化的特性[15, 16]。
图2 脱除内源性成分后的2种米粉XRD谱图
去除不同内源性非淀粉物质后,2种米粉的特征衍射峰位置没有变化,说明内源性非淀粉物质并不影响样品的淀粉晶体类型。相对结晶度代表淀粉结晶区域的完整性,与淀粉的糊化性质和消化率有关[17]。HR、HR-l、HR-c、HR-p、HRS和LR、LR-l、LR-c、LR-p、LRS的相对结晶度分别为38.5%、35.4%、36.6%、38.6%、37.6%和35.8%、33.4%、37.0%、44.8%、42.4%。2种米粉的内源非淀粉成分对于相对结晶度起着不同的作用。在HR样品中,内源性非淀粉物质的去除对相对结晶度没有显著影响。而在LR样品中,去除蛋白质和膳食纤维后,米粉的相对结晶度从35.8%分别增加至44.8%和37.0%,这可能因为蛋白质和膳食纤维的去除导致了支链淀粉双螺旋结构的重新排列[18],从而增加了淀粉酶的可及性,促进淀粉的消化。此外,去除蛋白质后增加的结晶度大于去除膳食纤维增加的结晶度,这可能是因为蛋白质在米粉中的含量远高于膳食纤维,所以其对相对结晶度的影响更大。Singh等[19]在研究碾磨玉米粉的过程中也发现了类似的结论,随着蛋白质的连续去除,结晶度逐渐增加。
经过不同处理的HR和LR样品的傅里叶红外光谱如图3所示,脱除内源性成分后傅里叶红外光谱的特征峰并无显著区别。1 045 cm-1处的吸收峰与淀粉的晶体结构有关,1 022 cm-1处的吸收峰与淀粉的非晶体结构有关[20],研究表明含有更多短程有序结构的淀粉有更强的抑制消化酶扩散的能力[21]。
图3 脱除内源性成分后的2种米粉傅里叶红外光谱图
从表3中可以看出,LR米粉的短程有序度(0.765±0.002)大于HR的短程有序度(0.737±0.001),这说明LR的低GI特性部分来自于它更大的短程有序结构。对于LR和HR,膳食纤维的脱除降低了米粉的短程有序度,分别降低至0.719±0.000和0.776±0.007;但脂质的去除对短程有序度的影响不大,而蛋白质的去除则将LR样品的短程有序度提高至0.754±0.007。这可能是因为膳食纤维的去除提高了大米淀粉的短程有序度,破坏了更多的短程双螺旋[22],导致淀粉的无定形区更易暴露于淀粉酶,从而促进了淀粉的消化。
经过不同处理的HR和LR样品的糊化特性如表4所示,RVA曲线如图4所示。淀粉糊化过程中,水分子会分散淀粉,进入淀粉微晶体并破坏氢键,淀粉分子从有序状态变为无序状态,双折射现象消失,黏度急剧上升,形成淀粉糊。对大米而言,内源性非淀粉物质会通过影响水分进入淀粉,从而影响大米淀粉凝胶化[23]。
图4 脱除内源性成分后的2种米粉RVA曲线图
表4 脱除内源性成分后的2种米粉糊化特性
HR的峰值黏度(3 418±61)mPa·s显著高于LR的峰值黏度(2 622±49)mPa·s,说明HR的淀粉吸水、溶胀和凝胶化程度更大。在内源性非淀粉物质的影响上,脱脂米粉与原米粉的峰值黏度差异不显著,说明脂质的去除对淀粉糊化中的峰值黏度影响不大,这与前人对脱脂米粉和米粉膨胀特性的研究结果不一致[24]。虽然脂质与大米淀粉在加热过程中可以形成淀粉-脂质复合物[25, 26],并抑制淀粉的膨胀,但米粉中脂质含量很低,作用非常有限。去除膳食纤维或蛋白质都会降低米粉的峰值黏度,去除蛋白质使HR和LR峰值黏度分别降低了5.5%和14.0%,去除膳食纤维使HR和LR峰值黏度分别降低了24.4%和26.4%,膳食纤维对峰值黏度的影响显著大于蛋白质,这意味着膳食纤维可能在糊化米粉的黏度中发挥更重要的作用。此外,HRS和LRS的峰值黏度分别为(4 649±202)、(3 460±75)mPa·s,显著高于相应米粉。
样品的终值黏度是RVA的另一个重要特征值,它与食物食用时的黏度有关,通常会影响食物的消化速度。仅有LR的膳食纤维使终值黏度降低,HR和LR的其他内源性非淀粉物质的脱除对米粉的终值黏度无显著影响,这意味着只有LR的膳食纤维对米粉的终值黏度起重要作用。
崩解值也是评价淀粉糊化性能的重要指标[27],其反映了达到峰值黏度后的淀粉颗粒继续受热时发生破碎的损伤程度,热稳定性差的淀粉具有较高的崩解值。从崩解值来看,去除蛋白质和膳食纤维都降低了米粉的崩解值,去除蛋白质使HR和LR的崩解值分别从(1 512±7)、(936±11)mPa·s降低至(1 198±27)、(576±8)mPa·s,去除膳食纤维更大程度上降低了淀粉的崩解值,去除膳食纤维也使HR和LR的崩解值分别降低至(675±33)、(344±2)mPa·s。这表明了蛋白质和膳食纤维的去除降低了糊化时米粉颗粒的破碎程度,增加了米粉的稳定性,这一结论与Lutfi等[28]和Zheng等[29]的研究结果相似。
由此可见,在这2个大米品种中,蛋白质和膳食纤维可以不同程度地限制水分子进入淀粉分子,抑制淀粉的糊化,并且影响淀粉糊的最终黏度,从而减缓了淀粉的消化速率,而脂质作用不大。其中,虽然蛋白质的含量远高于膳食纤维和脂质,但是膳食纤维对于峰值黏度、终值黏度和崩解值的影响更大。
利用扫描电镜观察了经过不同处理的HR和LR样品的表面形貌特征(图5)。未处理的2种米粉颗粒相对较大,为10~23 μm,形状不规则,结构紧凑,HR的米粉颗粒相较LR小5~8 μm。去除脂质后,样品中存在的小颗粒的比例减少。当去除蛋白质或膳食纤维时,样品的微观结构发生了显著变化,单个颗粒的尺寸减小至3~8 μm,其形状变成多面体,与相对应的淀粉样结构十分相似。去除蛋白质或者膳食纤维后,HR的米粉颗粒相较LR大2~3 μm。这些结果表明,米粉中存在的蛋白质和膳食纤维共同包裹淀粉颗粒,可以限制淀粉粒的膨胀及其与消化酶的接触,从而减缓淀粉消化。
图5 脱除内源性成分后的2种米粉SEM图(2 000倍)
比较脱除内源性非淀粉物质后GI值不同2种大米米粉的体外消化、理化特性和微观结构的影响,结果表明:对于LR,内源蛋白质和膳食纤维的脱除可以促进大米淀粉消化,脱除脂质对大米淀粉消化的影响有限,而HR的内源性非淀粉物质对于淀粉消化性的影响并不显著。HR的膨胀力显著高于LR,溶解度则反之,蛋白质和膳食纤维能显著限制HR的膨胀力,并限制消化酶接近淀粉分子。内源性非淀粉物质不改变淀粉的晶体类型,去除蛋白质和膳食纤维显著提升了淀粉的相对结晶度,增加淀粉酶的可及性。脱除内源性非淀粉物质对于淀粉的热力学特性和糊化特性有显著影响,影响的程度为蛋白质>膳食纤维>脂质,并且在LR中的影响更加显著。去除膳食纤维降低了淀粉的短程有序度,蛋白质和膳食纤维包裹淀粉形成大块颗粒,抵抗淀粉酶的消化。
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