TLR-7,对阿尔茨海默病细胞模型β,淀粉样蛋白表达及炎症反应的调控作用及机制

李 娟 蔡 萃 聂 晶 吴宇婧 张东阳

阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种起病隐匿的进行性发展的中枢神经系统退行性疾病，临床表现为认知、记忆、语言、活动能力等障碍，可改变患者人格及行为等[1]。研究[2]发现，AD 的发病具有明显的家庭聚集性，其中β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）基因多个位点的突变与AD 的发病密切相关。APP 是在多种细胞和组织中表达的内在膜蛋白，在β 淀粉样前体蛋白裂解酶1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）等蛋白酶的作用下水解成为β 淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ），并在神经细胞中沉积产生神经毒性，导致神经细胞功能损伤，引起AD 的发生[3]。Toll 样受体（Toll-like receptor，TLRs）同源分子是典型的跨膜模式识别受体，可以响应多种细胞内外信号的刺激，调控细胞炎症因子的表达和分泌，引发炎症反应及促进抗原提呈细胞的成熟，诱导机体的获得性免疫反应[4]。其中，Toll 样受体7（Toll-like receptor 7，TLR-7）可以识别微小RNA（microRNA，miRNA），并通过与miRNA 的结合参与多种细胞生理活动的调节[5]。研究发现，TLR-7 可能在神经炎症反应中发挥了重要作用[6]，但其在AD 中的功能仍不清楚。本研究显示，在AD 模型人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中，沉默TLR-7 通过靶向微小RNA-15b（miR-15b）介导核因子κB（NF-κB）信号传导及与BACE1 的表达，抑制神经细胞Aβ 的异常积累和炎症因子分泌，缓解了APP 突变引起的神经细胞损伤。

1.1 试 剂 DMEM 高糖培养基（货号11965095）、胎牛血清（货号10091148）、胰酶消化液（货号25200072）、Lipofectamine 2000 转染试剂（货号11668019）购自美国赛默飞世尔科技公司；
总RNA提取试剂盒（货号DP451）、逆转录试剂盒（货号KR116）、实时荧光定量PCR 试剂（货号FP201）购自北京天根生物科技公司；
双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号E1910）购自美国普洛麦格公司；
Aβ、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附试剂盒（货号DAB142、MLB00C、D6050、DTA00D）购自美国R&D 公司；
兔抗APP 抗体、β-肌动蛋白、山羊抗兔二抗（货号ab32136、ab8653、ab6721）购自美国Abcam 公司。

1.2 仪 器 CO2培养箱（3111-GP，Thermo 公司）；
酶标仪（800Ts，Bio-Rad 公司）；
流式细胞仪（Novo-Cyte，Aceabio 公司）；
荧光PCR 仪（QuantStudioTM5，Thermo 公司）。

1.3 AD 细胞模型的建立 人胚肾细胞系HEK293T（货号ZQ0033，中乔新舟）和人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y（货号YS3685C，上海雅吉生物）在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中传代培养。APP 瑞典家系突变（APP695 KM670/671NL，APPswe）慢病毒包装质粒pLenti-APPswe 由本研究室构建，pLenti-APPswe 质粒与慢病毒包装辅助质粒共同转染HEK293T 细胞，转染48 h 后，收集培养基上清液，用0.45 μm 一次性滤器过滤后，加入SH-SY5Y 细胞培养基中，孵育24 h 后，加入含1.5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培养基继续培养48 h，最终得到APP 瑞典家系突变人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y/APPswe）。

1.4 细胞转染和分组 以上述获得的SH-SY5Y/APPswe 和SH-SY5Y 细胞为研究对象，按照1.3 中的转染方法，将TLR-7 敲低质粒（sh-TLR-7）、对照质粒（sh-NC）、miR-15b 抑制质粒（miR-15b inhibitor）和对照质粒（inhibitor NC）分别转染至SH-SY5Y/APPswe 细胞中。将细胞分为SH-SY5Y 组、SHSY5Y/APPswe 组、TLR-7 敲 低SH-SY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7）组、敲低对照SHSY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-NC）组、TLR-7敲低+miR-15b 抑制SH-SY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor）组和TLR-7敲低+miR-15b 抑制对照SH-SY5Y/APPswe（SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC）组。各组转染细胞系培养24 h 后收集细胞进行检测。

1.5 实时荧光定量PCR 离心收集各组细胞，加入1 mL 预冷的Trizol 裂解液室温放置5 min；
加入200 μL 氯仿，充分混匀后经12000 g 4 ℃离心10 min，取上层水相500 μL，加入等体积异丙醇，12000 g 4 ℃离心10 min，弃去上清；
加入1 mL 75%乙醇漂洗2次，加入无RNA 酶的焦磷酸二乙酯（DEPC）水30 μL使沉淀充分溶解总RNA。取1 μg 总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再行PCR 扩增目标基因。将所得cDNA 加至PCR 反应体系中扩增目标片段，PCR 反应体系为20 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性15 min 后，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。最后一次循环后做溶解曲线，并采用β肌动蛋白（β-actin）做标准曲线作为参考值，所需引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

1.6 酶联免疫吸附实验 用无菌管收集各组细胞培养基，1000 r/min 离心10 min，加入预先包被抗体的酶标板中，并设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL。4 ℃孵育2 h，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，4 ℃孵育2 h，随后用漂洗液充分漂洗5 次。最后在每孔加入显色底物50 μL，室温避光孵育15 min 后，加入终止液50 μL，立即酶标仪读取450 nm 波长处测定各孔的OD 值。根据标准品孔实验数据绘制Aβ、IL-1β、IL-6 和TNF-α 标准曲线，并计算各样本孔待测样品浓度。

1.7 蛋白质印迹实验 离心收集SH-SY5Y 细胞和SY-SY5Y/APPswe 细胞，加入200 μL 4 ℃预冷的放射免疫沉淀法裂解缓冲（RIPA）细胞裂解液，冰上裂解20 min，离心后取其上清液；
采取BCA 法测定蛋白浓度，并调整蛋白提取液的浓度，加入5×SDS 上样缓冲液，煮沸加热5 min。在100 V 恒压条件下进行SDS-PAGE 凝胶电泳90 min，结束后，继续在100 V恒压条件下转膜2 h，后将带有蛋白样品的PVDF 膜于5%脱脂奶粉中封闭1 h，随后分别用兔抗APP 抗体（1∶3000 稀释）、β-肌动蛋白（1∶4000 稀释）和HRP山羊抗兔二抗（1∶8000 稀释），室温各孵育2 h。充分漂洗后，在膜上滴加化学发光底物，用凝胶成像仪获取蛋白印迹图片。

1.8 荧光素酶报告基因实验 用Lipofectamine 2000 转染试剂转染，将NF-κB 荧光素酶报告基因质粒pNF-κB-Luc 和对照质粒pRL-TK 转染各组细胞24 h，弃掉上清，在细胞培养板中加入500 μL 细胞裂解液，室温静置5 min，随后取20 μL 细胞裂解液加入白色不透光96 孔板，每组设置3 个复孔。先后在孔中加入萤火虫荧光素酶底物和海参荧光素底物，用酶标仪读取300～700 nm 波长自发光信号。

1.9 统计学方法 应用SPSS 18.0 软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用独立样本t 检验，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2.1 SH-SY5Y 细胞AD 模型的建立 蛋白质印迹实验结果表明，与正常SH-SY5Y 细胞相比，慢病毒稳定转染的SH-SY5Y/APPswe 细胞APP 695 亚型表达水平上调，表明稳定细胞系构建成功，见图1。

图1 蛋白质印迹实验检测APP 的表达

2.2 敲低TLR-7 对miR-15b 和BACE1 mRNA 表达及Aβ42 分泌的影响 实时荧光定量PCR 实验检测各组细胞中TLR-7、BACE1 mRNA 和miR-15b 的表达水平。酶联免疫吸附实验检测Aβ 分泌水平。与SH-SY5Y 组细胞比较，AD 模型SH-SY5Y/APPswe组细胞TLR-7、BACE1 mRNA 和miR-15b 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），而分泌到培养基中的Aβ42 水平则显著升高（P＜0.01）。与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组细胞TLR-7、BACE1 mRNA 表达水平显著下降（P＜0.01），miR-15b 表达水平显著升高（P＜0.01），Aβ42分泌水平明显降低（P＜0.01），见表2。

表2 敲低TLR-7 对BACE1 mRNA、miR-15b 表达和Aβ42 分泌的影响（±s）

表2 敲低TLR-7 对BACE1 mRNA、miR-15b 表达和Aβ42 分泌的影响（±s）

注：SH-SY5Y 为人神经母细胞瘤细胞；
SH-SY5Y/APPswe 为APP 瑞典家系突变转染SH-SY5Y；
TLR-7 为Toll 样受体7；
BACE1 为β 淀粉样前体蛋白裂解酶1；
miR-15b 为微小RNA-15b；
Aβ42 为β 淀粉样蛋白42；
与SH-SY5Y 组比较，aP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，bP＜0.01

组别SH-SY5Y 组SH-SY5Y/APPswe 组SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组孔数3333 TLR-7 mRNA 1.00±0.00 0.97±0.03 0.98±0.07 0.15±0.02b BACE1 mRNA 1.00±0.00 0.94±0.06 1.02±0.03 0.72±0.06b miR-15b 1.00±0.00 1.08±0.06 1.10±0.05 2.98±0.21b Aβ42（ng/mL）2.09±0.17 11.24±0.76a 10.52±0.67 6.09±0.42b

2.3 TLR-7 通过miR-15b 调控BACE1 的表达及Aβ42 分泌 实时荧光定量PCR 和酶联免疫吸附实验显示，与SY-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组BACE1 mRNA 表达和Aβ42 分泌显著降低（P＜0.01，P＜0.05），miR-15b 表达明显升高（P＜0.01）；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组比较，同时敲低TLR-7 和miR-15b的SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor组BACE1 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05），Aβ42 分泌水平明显升高（P＜0.01），miR-15b 表达水平下降（P＜0.01），见表3。

表3 敲低TLR-7 与抑制miR-15b 对BACE1 mRNA、miR-15b 表达和Aβ42 分泌的影响（±s）

表3 敲低TLR-7 与抑制miR-15b 对BACE1 mRNA、miR-15b 表达和Aβ42 分泌的影响（±s）

注：SH-SY5Y 为人神经母细胞瘤细胞；
SH-SY5Y/APPswe 为APP 瑞典家系突变转染SH-SY5Y；
BACE1 为β 淀粉样前体蛋白裂解酶1；
miR-15b为微小RNA-15b；
Aβ42 为β 淀粉样蛋白42；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+shTLR-7+inhibitor NC 组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别SH-SY5Y 组SH-SY5Y/APPswe 组SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组孔数333333 BACE1 mRNA 1.00±0.00 1.02±0.04 1.10±0.06 0.69±0.07b 0.71±0.05 1.39±0.42c miR-15b 1.00±0.00 0.95±0.11 1.03±0.07 3.32±0.19b 2.96±0.35 0.67±0.13d Aβ42（ng/mL）2.32±0.68 13.65±1.98 14.77±2.74 6.99±1.85a 7.47±1.58 19.54±3.01d

2.4 TLR-7 通过miR-15b 调控炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 的表达和分泌 实时荧光定量PCR 实验结果表明，与SH-SY5Y 组细胞比较，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 组细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）。与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平显著下降（P＜0.01）。与SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组细胞比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组 细 胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01），见表4。

表4 各组细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达比较（±s）

表4 各组细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达比较（±s）

注：SH-SY5Y 为人神经母细胞瘤细胞；
SH-SY5Y/APPswe 为APP 瑞典家系突变转染SH-SY5Y；
IL-1β 为白介素-1β；
IL-6 为白介素-6；
TNF-α为肿瘤坏死因子-α；
与SH-SY5Y 组比较，aP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，bP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC组比较，cP＜0.01

组别SH-SY5Y 组SH-SY5Y/APPswe 组SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组孔数333333 IL-1β 1.00±0.00 4.95±0.28a 4.62±0.41 3.34±0.25b 3.55±0.33 6.07±0.43c IL-6 1.00±0.00 5.90±0.47a 5.43±0.31 3.75±0.34b 4.02±0.22 5.98±0.28c TNF-α 1.00±0.00 1.98±0.14a 2.07±0.18 1.25±0.11b 1.36±0.20 1.88±0.21c

酶联免疫吸附实验结果表明，与SH-SY5Y 组比较，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 组IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平显著升高（P＜0.01）。与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平显著下降（P＜0.01）。与SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC组比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平显著升高（P＜0.05），见表5。

表5 各组细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平比较（pg/mL，±s）

注：SH-SY5Y 为人神经母细胞瘤细胞；
SH-SY5Y/APPswe 为APP 瑞典家系突变转染SH-SY5Y；
IL-1β 为白介素-1β；
IL-6 为白介素-6；
TNF-α为肿瘤坏死因子-α；
与SH-SY5Y 组比较，aP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，bP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC组比较，cP＜0.05

组别SH-SY5Y 组SH-SY5Y/APPswe 组SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组孔数333333 IL-1β 57.20±4.95 112.43±10.89a 101.76±7.95 61.40±7.76b 68.62±5.41 155.32±13.67c IL-6 117.62±19.57 982.42±78.84a 893.35±101.43 547.29±39.11b 439.73±60.01 1255.49±119.79c TNF-α 137.89±21.37 356.17±29.08a 375.28±33.99 256.17±24.32b 227.82±26.53 423.66±34.32c

2.5 TLR-7 通过miR-15b 调控NF-κB 信号通路的激活 荧光素酶报告基因实验结果显示，与SHSY5Y 组比较，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 组NF-κB荧光素酶活性显著升高（P＜0.01）。与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组NF-κB 荧光素酶活性显著下降（P＜0.01）。与SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组比较，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组NFκB 荧光素酶活性显著升高（P＜0.01），见表6。

表6 各组细胞NF-κB 相对荧光素酶活性（±s）

表6 各组细胞NF-κB 相对荧光素酶活性（±s）

注：SH-SY5Y 为人神经母细胞瘤细胞；
SH-SY5Y/APPswe 为APP 瑞典家系突变转染SH-SY5Y；
NF-κB 为核因子κB；
与SH-SY5Y 组比较，aP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组比较，bP＜0.01；
与SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组比较，cP＜0.01

组别SH-SY5Y 组SH-SY5Y/APPswe 组SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 组SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 组孔数333333相对荧光素酶活性1.00±0.00 5.27±0.44a 5.01±0.52 3.25±0.31b 3.58±0.27 5.91±0.66c

尽管AD 是一类多因素疾病，但Aβ 的异常积累被认为是诱发AD 的最主要因素，APP 蛋白在以BACE1 为主的水解酶作用下分解产生Aβ，并伴随自由基释放，引发细胞氧化损伤，诱发慢性炎症，进而影响神经细胞膜结构与功能[7]。研究[8]发现，BACE1 在AD 患者大脑中的表达和活性水平均呈现明显的增强，因而BACE1 一直被作为AD 治疗和药物开发的重要靶点。此外，研究BACE1 在AD 疾病进展中的调控机制，也是该领域的热点问题。神经系统慢性炎症反应伴随了AD 的整个发病过程，在正常的生理状态下，神经炎症有助于神经系统损伤的修复，而当炎症反应过度时则会造成细胞损伤，加速AD 恶化，因此，炎症反应在AD 中极其重要，适度调控炎症反应将对AD 的治疗大有裨益[9]。TLR-7 受体及其下游信号通路在炎症反应的调控中发挥了重要作用。Mottas 等[10]研究发现，TLR-7 可以诱导Aβ 摄取及炎症反应，从而在AD 发病过程中发挥作用，而Ren 等[11]研究发现，TLR-7 的激活可以下调B 淋巴细胞miR-15b 的表达。本研究发现，在过表达APPswe 的AD 模型SH-SY5Y 细胞中，敲低TLR-7 可导致miR-15b表达水平的上调和BCAE1 表达水平下调，并抑制了Aβ42 的分泌（P＜0.01）。为了进一步研究TLR-7 是否通过miR-15b 调控BACE1 的表达，本研究通过miR-15b inhibitor 在TLR-7 敲低的细胞中进一步抑制miR-15b 的表达，结果证实了抑制miR-15b 可以恢复SH-SY5Y/APPswe 细胞BCAE1 mRNA 的表达和Aβ42 的分泌（P＜0.05，P＜0.01）。

有研究[12]发现，NF-κB 的激活在包括AD 在内的神经炎症性疾病中扮演着重要的角色，在AD 发病过程中，Aβ 诱导的NF-κB 激活上调了促炎细胞如IL-1β、IL-6 等的表达，也有研究[13]表明，NF-κB 活化可刺激BACE1 和APP 的表达。本研究也发现，在SH-SY5Y/APPswe 细胞中，TLR-7 可以通过miR-15b 调控NF-κB 的转录活性及IL-1β、TNF-α 和IL-6 等炎症因子的分泌，这提示TLR-7/miR-15b 对BACE1 和Aβ 分泌的影响可能是通过对NF-κB 信号调节实现的。

综上所述，本研究揭示了TLR-7/miR-15b 对AD 模型SH-SY5Y/APPswe 细胞的Aβ 分泌和炎症因子表达的重要调控作用和分子机制，提示TLR-7/miR-15b 在抑制Aβ 积累和神经炎症反应中潜在的靶点作用，为AD 的致病机制和干预策略的研究提供了新思路。

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