两种克班宁长循环纳米粒的急性毒性与抗心律失常作用研究

崔利利，孔淑君，程欣，金文彬，徐颖，张景莲，王丽，马云淑，4，5（.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500；
2.云南省高校外用给药系统与制剂技术重点实验室，云南 昆明 650500；
3.迪沙药业集团有限公司，山东 威海 264200；
4.云南省傣医药与彝医药重点实验室，云南 昆明 650500；
5.云南省药食同源饮品工程研究中心，云南 昆明 650500）

克班宁（Crebanine，Cre）是一种异喹啉类阿朴菲型生物碱[1]，在防己科千金藤属植物中含量较高，提取方法较简便[2]。克班宁静脉注射及贴剂对BaCl2、乌头碱、CaCl2、氯仿、肾上腺素引起的多种动物心率失常有效[3-4]；
能减少心肌缺血及梗死面积，对心肌缺血再灌注损伤有良好的保护作用[5]。尽管克班宁抗心律失常活性强，起效快，但其不够稳定，遇光、高温易氧化变色，静脉注射毒性大、半衰期短，小鼠静脉注射LD50为9.382mg·kg-1，大鼠静脉注射t1/2β为（36.67±5.52）min，治疗指数小[6-7]。针对克班宁上述问题，课题组前期试制了氰基丙烯酸正丁酯微粒[8]、脂质体[9-10]、经皮贴剂[11]以期达到减毒保效的作用，但存在载药微粒不够稳定、毒性降低不明显、缓释效果不足或起效较慢等问题。为此，课题组以两种PEG修饰载体材料为载体，制备了克班宁长循环纳米粒（PELGE-Cre-NPs、PLGA-Cre-NPs），并对其组织分布及药动学参数进行分析[12-13]。

本实验旨在研究PELGE-Cre-NPs与PLGA-Cre-NPs的毒性，并采用氯仿诱发小鼠心室纤颤模型、氯化钡（BaCl2）及乌头碱致心律失常模型，对两种长循环纳米粒进行抗心律失常活性药效研究和作用机制初步分析，并与克班宁静脉注射进行药效作用比较，以期为改善克班宁的药性、研究开发克班宁新型纳米制剂提供实验依据。

1.1 动物KM小鼠，SPF级，110只体质量28～35 g，160只体质量18～22 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号：110324220108015825，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0003。SD大鼠，SPF级，100只体质量250～300 g，72只体质量180～220 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号：110324241100065851，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。本实验经云南中医药大学动物福利与伦理委员会审批通过，审批伦理号：R-062016002。

1.2 药物及试剂乌头碱，批号：20130926，购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%；
氯化钡，批号：20150401，购于天津市光复科技发展有限公司，纯度≥98%；
维拉帕米注射液，批号：43150401，购于上海禾丰制药有限公司；
盐酸利多卡因注射剂，批号：115056，购于山东华鲁制药有限公司；
氯化钠注射液，批号：20150917，购于昆明南疆制药有限公司；
75%乙醇消毒液，批号：121002，购于昆明远方生物制品有限公司；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA；
批号：20140921，截留相对分析质量20 kDa）、聚乙二醇（-聚乳酸-羟基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物（PELGE；
批号：20140918，截留相对分析质量4-20-4 kDa），购于济南岱刚生物科技有限公司；
PLGA-Cre-NPs（1.5 mg·mL-1），自制，包封率：87.51%；
PELGE-Cre-NPs（1.5 mg·mL-1），自制，包封率：91.66%。

1.3 仪器BT25S十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；
WZ-50C6微量注射泵、WZ-50C6T微量注射泵，浙江史密斯医学仪器有限公司；
BL-420E生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；
一次性使用无菌注射器，上海康寿医疗器械有限公司；
0.45μm尼龙水系微孔滤膜，天津市津腾实验设备有限公司。

1.4 急性毒性试验预试验取健康小鼠40只，体质量18～22 g，随机分成10组，每组4只，雌雄各半。PLGA-Cre-NPs、PELGE-Cre-NPs分别设置40、20、10、5、2.5 mg·kg-15个剂量组。尾静脉注射给药后观察各组小鼠的中毒反应及死亡情况，并持续观察14 d，记录小鼠的死亡情况，找出引起动物0%（Dn）和100%（Dm）死亡的剂量，以此作为依据，计算正式试验分组的组距。实验初步得出引起小鼠死亡的剂量，PLGA-Cre-NPs：Dm=20 mg·kg-1，Dn=10 mg·kg-1；
PELGE-Cre-NPs：Dm=20 mg·kg-1，Dn=10mg·kg-1。

1.5 半数致死量（LD50）的测定各组试验在10 mg·kg-1与20 mg·kg-1之间设6个剂量组，每组10只，雌雄各半，给药剂量按等比递减，组间剂量比值为0.9。PLGA-Cre-NPs剂量组依次设置为17.78、16.00、14.40、12.80、11.67、10.50mg·kg-1，PELGE-Cre-NPs剂量组依次设置为20.00、18.00、16.20、14.58、13.12、11.81 mg·kg-1。各组均采取尾静脉注射给药，观察并记录各组小鼠的中毒反应及死亡情况。

1.6 氯仿诱发小鼠心室纤颤分组与给药取体质量为28～35 g的健康小鼠110只，随机分为11组，每组10只，雌雄各半；
分为正常对照组、模型对照组、利多卡因阳性对照组（5 mg·kg-1）、维拉帕米阳性对照组（4 mg·kg-1）、克班宁[14]实验组（Cre，5 mg·kg-1）、PLGA-Cre-NPs和PELGE-Cre-NPs高（5 mg·kg-1）、中（2.5mg·kg-1）、低（1.25mg·kg-1）剂量组。各组均尾静脉注射，给药5 min后，除正常对照组外，其他各组实验动物均放入含4 mL氯仿棉球（每换一只小鼠追加氯仿1 mL）的500 mL倒置烧杯中，待小鼠呼吸停止后，立即取出；
快速剖开胸腔，观察小鼠心室是否纤颤[10]，记录结果并进行统计比较。

1.7 BaCl2诱发大鼠心律失常动物分组与给药以BaCl2诱发过速型心律失常模型[15]为抗心律失常的经典模型，研究不再设立正常对照组。取SD大鼠，体质量250～300 g，随机分为10组，每组10只，雌雄各半，分别为模型对照组（4mL·kg-1），利多卡因阳性对照组（5mg·kg-1），维拉帕米阳性对照组（5mg·kg-1），克班宁实验组（5 mg·kg-1），PLGA-Cre-NPs和PELGE-Cre-NPs高（5 mg·kg-1）、中（2.5 mg·kg-1）、低（1.25 mg·kg-1）剂量组。将大鼠麻醉仰位固定于鼠板上，连接心电信号采集系统，连接Ⅱ导联，并记录一段正常心电图。舌下静脉注射BaCl2溶液4 mg·kg-1，观察心电图，待出现心律失常3 min后，舌下静脉注射给药。观察各组大鼠恢复窦性心律的情况，并详细记录各组能够恢复窦性心律的大鼠数量、窦性心律维持时间大于5 min的数量和窦性心律维持时间大于20 min的数量。

1.8 乌头碱诱发的大鼠心律失常动物分组与给药以乌头碱诱发的大鼠心律失常模型为抗心律失常的经典模型[16]，研究不再设立正常对照组。取SD大鼠，体质量180～220 g，随机分9组，每组8只，雌雄各半。分别为模型对照组（4 mL·kg-1），利多卡因阳性对照组（5 mg·kg-1），克班宁实验组（5 mg·kg-1），PLGA-Cre-NPs和PELGE-Cre-NPs高（5 mg·kg-1）、中（2.5 mg·kg-1）、低（1.25 mg·kg-1）剂量组。将大鼠麻醉仰位固定于鼠板上，连接心电信号采集系统，连接Ⅱ导联，记录一段正常心电图。分离一侧股静脉，舌静脉注射药物，5 min后，用微量泵以每分钟10μg·mL-1的速度于股静脉恒速输注乌头碱溶液，连续记录Ⅱ导联心电图，分别记录各组动物发生室性早搏（VPB）、室性心动过速（VT）、心室纤颤（VF）及心脏停搏（CA）所需的时间。

1.9 统计学处理方法采用统计软件SPSS 19.0进行分析，对小鼠的室颤发生率、BaCl2诱发过速型心律失常大鼠模型的数据采用卡方检验（α=0.05），对乌头碱诱发的大鼠心律失常的影响，将记录的时间换算成乌头碱的给药量（每分钟10μg·mL-1），先进行组间方差齐性检验，得出F值及P值（α=0.05）。方差齐则进行t检验，方差不齐则进行t’检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 急性毒性试验结果给予PELGE-Cre-NPs、PLGA-Cre-NPs后，两者中毒症状相似，出现瞳孔放大、眼球突出、竖尾、弹跳、抽搐、呼吸急促、流涎、小便失禁、死亡等症状。各剂量组给药后，由高到低剂量组，PLGA-Cre-NPs各组的死亡率分别为100%、80%、70%、30%、20%、0%；
PELGE-Cre-NPs各组的死亡率分别为90%、80%、70%、50%、30%、10%。使用统计软件SPSS 19.0，采用机率单位加权回归法（Bliss法），分别计算PELGE-Cre-NPs、PLGA-Cre-NPs的LD50。PLGA-Cre NPs的半数致死量LD50=13.619 mg·kg-1，回归方程：Y［PROBIT（p）］=-18.803（mg·kg-1）+16.579 l g（D），LD5095%的可信限为12.802～14.499 mg·kg-1，LD5=10.838 mg·kg-1，LD95=17.115 mg·kg-1。PELGE-Cre-NPs的半数致死量LD50=14.839 mg·kg-1，回归方程：Y［PROBIT（p）］=-12.694（mg·kg-1）+10.837 lg（D），LD5095%的可信限为18.126～28.699 mg·kg-1，LD5=10.462 mg·kg-1，LD95=21.046 mg·kg-1。

2.2 纳米粒对氯仿诱发小鼠心室纤颤的影响见表1。正常对照组小鼠室颤率为0%，模型对照组小鼠室颤率为90%，提示小鼠纤颤造模成功。与模型对照组比较，利多卡因阳性组、维拉帕米阳性组能够明显对抗氯仿诱发的小鼠心室纤颤（P＜0.01）。与模型对照组比较，PLGA-Cre-NPs高、中剂量组和PELGECre-NPs高、中、低剂量组能够明显对抗氯仿诱发的小鼠心室纤颤（P＜0.01）；
PLGA-Cre-NPs低剂量组、Cre实验组能够对抗氯仿诱发的小鼠心室纤颤（P＜0.05）。PLGA-Cre-NPs和PELGE-Cre-NPs的各剂量组分别与维拉帕米阳性组、利多卡因阳性组、克班宁实验组比较，P值均大于0.05，提示这两种纳米粒对抗氯仿诱发小鼠心室纤颤的效果与上述各药物的差异无统计学意义。

表1 各组对氯仿诱发小鼠心室纤颤模型的影响（n=10）Table 1 Effects of chloroform-induced ventricular fibrillation in mousemodels（n=10）

2.3 纳米粒对BaCl2诱发的大鼠心律失常的影响见表2。与模型对照组比较，利多卡因阳性组恢复窦性心律的大鼠数量及窦性心律维持时间≥5 min的大鼠数量均明显上升（P＜0.001），提示利多卡因能够明显对抗BaCl2诱发的过速型心律失常，此实验体系可信。

表2 各组对BaCl2诱发大鼠心律失常的影响（n=10）Table 2 Effects of BaCl2-induced arrhythmia in rats（n=10）

以恢复的大鼠数量为标准，与模型对照组比较，克班宁实验组（P＜0.001）、PLGA-Cre-NPs高（P＜0.001）、中（P＜0.001）、低（P＜0.05）剂量组和PELGE-Cre-NPs高（P＜0.001）、中（P＜0.001）、低（P＜0.01）剂量组能够对抗BaCl2诱发的过速型心律失常，增多恢复的大鼠数量。

以维持时间≥5min的数量为标准，与模型对照组比较，PELGE-Cre-NPs高（P＜0.001）、中（P＜0.01）剂量组及PLGA-Cre-NPs高（P＜0.01）剂量组能够对抗BaCl2诱发的过速型心律失常，增多窦性心律维持时间≥5 min的大鼠的数量。与克班宁验组及维拉帕米阳性组比较，PELGE-Cre-NPs高剂量组恢复窦性心律维持时间≥5min的大鼠数量明显增多（P＜0.05），以维持时间≥20 min的数量为标准，与模型对照组比较，PELGE-Cre-NPs高剂量组（P＜0.01）、PLGACre-NPs高剂量组（P＜0.05），能够对抗BaCl2诱发的过速型心律失常，增多窦性心律维持时间≥20 min的大鼠的数量。以上提示PELGE-Cre-NPs、PLGACre-NPs能延长恢复窦性心率后的维持时间。

2.4 纳米粒对乌头碱诱发的大鼠心律失常的影响见表3。与模型对照组比较，利多卡因阳性组可提高乌头碱致VPB的阈剂量（P＜0.05），对乌头碱致VT、VF、CA等的阈剂量均明显增加（P＜0.001），提示利多卡因阳性组有明显对抗乌头碱致VPB、VT、VF、CA的作用，此实验体系可信。

表3 各组对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响（±s，n=8）Table 3 Effects on arrhythmia induced by aconitine in rats（±s，n=8）

表3 各组对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响（±s，n=8）Table 3 Effects on arrhythmia induced by aconitine in rats（±s，n=8）

注：t检验。与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与利多卡因阳性组比较，##P＜0.01；
与克班宁组比较，ΔP＜0.05

组别模型对照组利多卡因阳性组克班宁实验组PELGE-Cre-NPs高剂量组PELGE-Cre-NPs中剂量组PELGE-Cre-NPs低剂量组PLGA-Cre-NPs高剂量组PLGA-Cre-NPs中剂量组PLGA-Cre-NPs低剂量组剂量/（mg·kg-1）-5 5 5 2.5 1.25 5 2.5 1.25乌头碱阈剂量/（μg·kg-1）VPB 14.49±2.11 19.34±5.40*19.36±5.61*18.76±3.13**18.37±4.11*15.33±3.66 15.60±2.69 16.83±5.41 15.00±3.43 VT 18.31±4.08 40.39±4.05***31.60±11.41**29.56±8.33**31.06±7.91*18.38±2.83 39.28±7.74***20.33±4.31 20.29±3.78 VF 32.73±6.44 53.27±8.70***54.33±14.66**63.47±11.52***55.87±6.36***45.78±10.12**60.57±9.36***41.26±7.52*32.94±3.86 CA 60.71±4.48 77.75±4.86***78.28±15.37**93.88±12.35***##Δ 76.12±14.66*65.53±7.39 81.10±10.19***73.60±17.39 59.80±9.78

与模型对照组比较，克班宁实验组VPB的乌头碱阈剂量增加（P＜0.05），同时VT、VF、CA的乌头碱阈剂量明显增加（P＜0.01）。PELGE-Cre-NPs高剂量组VPB（P＜0.01）、VT（P＜0.01）、VF（P＜0.001）、CA（P＜0.001）的乌头碱阈剂量明显增加；
PELGECre-NPs中剂量组VPB（P＜0.05）、VT（P＜0.05）、CA（P＜0.05）、VF（P＜0.001）乌头碱阈剂量明显增加。PLGA-Cre-NPs高剂量组VT（P＜0.001）、VF（P＜0.001）、CA（P＜0.001）的乌头碱阈剂量明显增加；
PLGA-Cre-NPs中剂量组VF的乌头碱阈剂量增加（P＜0.05）。

与利多卡因阳性组比较，PELGE-Cre-NPs高剂量组CA的乌头碱阈剂量明显增加（P＜0.01），提示在乌头碱致CA方面，PELGE-Cre-NPs高剂量比利多卡因的对抗作用明显。与克班宁实验组比较，PELGECre-NPs高剂量组CA的乌头碱阈剂量提高（P＜0.05），提示在乌头碱致CA方面，PELGE-Cre-NPs高剂量比克班宁的对抗作用明显。

本实验对PLGA-Cre-NPs、PELGE-Cre-NPs两种克班宁纳米粒制剂急性毒性及药效进行研究。急性毒性试验中发现，小鼠中毒症状表现为竖尾，继而弹跳，四肢持续猛蹬，瞳孔突出，嘴角流涎，小便失禁，抽搐死亡。实验中对已经停止呼吸的小鼠进行解剖，发现纳米粒组心跳仍在持续节律性跳动，并维持一定时间。纳米粒可能具有中枢和运动神经系统、自主神经系统、呼吸系统毒性[17-18]。但PLGACre-NPs（LD50=13.619 mg·kg-1）、PELGE-Gre-NPs（LD50=14.839 mg·kg-1）这两种纳米粒的毒性较克班宁（LD50=9.382 mg·kg-1）小[6]，可达到制剂减毒的目的，且PELGE-Cre-NPs的减毒效果比PLGA-Cre-NPs更好。

氯仿诱发小鼠心室纤颤研究表明，PLGA-Cre-NPs（1.25～5 mg·kg-1）和PELGE-Cre-NPs（1.25～5 mg·kg-1）能够明显对抗氯仿诱发的小鼠心室纤颤。PLGA-Cre-NPs和PELGE-Cre-NPs对抗氯仿诱发小鼠心室纤颤的作用与利多卡因、维拉帕米、克班宁相当。

氯化钡（BaCl2）诱导的大鼠心律失常作用机理与Ca2+相似，静脉注射给药后导致大鼠产生室性早搏、室性心动过速和心室颤动，与细胞膜上Ca2+的内流有关；
也可能是因为抑制K+的流出，因而增加四肢坡度，提高心房传导组织和房室束-浦顷野氏纤维等快反应细胞的自律性[19-20]。本实验中，PLGA-Cre-NPs（1.25～5mg·kg-1）、PELGE-Cre-NPs（1.25～5mg·kg-1）对BaCl2诱导的大鼠心律失常具有良好的抑制作用，与利多卡因（5 mg·kg-1）阳性组的差异无统计学意义。PELGE-Cre-NPs高剂量（5mg·kg-1）比克班宁（5mg·kg-1）、维拉帕米（5mg·kg-1）的抗心律失常作用更明显。

乌头碱诱发大鼠心律失常的模型机理，可能与其使心肌细胞Na+通道开放，加速Na+内流，促使细胞膜去极化，从而提高心房传导组织和房室束-浦顷野氏纤维等快反应细胞的自律性，导致形成一源性或多源性异位节律，缩短不应期有关[19-20]。本实验中，PLGA-Cre-NPs、PELGE-Cre-NPs能提高乌头碱诱发大鼠发生室性早搏（VPB）、室性心动过速（VT）、心室纤颤（VF）及心脏停搏（CA）的阈剂量。另外，值得关注的是，在提高心脏停搏的阈剂量方面，PELGECre-NPs高剂量（5mg·kg-1）明显优于利多卡因（5mg·kg-1）与克班宁（5 mg·kg-1）。以上说明，制备的克班宁纳米粒制剂能明显增加抗心律失常药效，抑制心肌细胞Na+通道开放，抑制心肌细胞的去极化作用[18，21]，且能延长乌头碱致室性早搏、室性心动过速和心室颤动、心脏停搏的时间，增加阈剂量，表现出纳米粒的延效作用。

综上所述，PLGA-Cre-NPs、PELGE-Cre-NPs这两种克班宁纳米粒较克班宁的毒性小，抗心律失常效果明显，在一定程度上达到了减毒增效作用；
其中，PELGE-Cre-NPs制剂比PLGA-Cre-NPs制剂的毒性更小，可为后期制剂开发提供实验依据。

（编辑：修春）

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