离子色谱法测定婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量

赫秀萍，王 渤，刘 强

(1 通标标准技术服务(青岛)有限公司，山东 青岛 266101；
2 赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 200120)

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖[1]。在自然界中，动物乳汁中存在GOS较少，而人类的母乳含量则较多。低聚半乳糖可有效促进肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，显著改善肠道菌群，改善人体肠道的消化吸收功能[2-4]。新生儿的消化功能比较薄弱，婴幼儿乳粉中基本都会添加低聚半乳糖这一功能性低聚糖。

关于食品中低聚半乳糖的使用量和标识要求，我国也做了相应的规定。GB 14880-2012[5]《食品营养强化剂使用标准》允许低聚半乳糖作为营养强化剂在婴幼儿配方食品、较大婴儿和配方食品中使用，但总量不超过64.5 g/kg。卫生部2008年第20号公告[6]批准低聚半乳糖作为新资源食品用于食品生产加工，使用范围为婴幼儿食品、乳制品、饮料、烘焙食品、糖果，使用量不大于12 g/天。GB 28050-2011[7]和GB 13432-2013[8]规定营养成分的实际含量不应低于相应标示值的80%。但是目前尚无婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量检测的相关标准。

低聚半乳糖是由具有不同聚合度或同一聚合度但含有多个不同糖苷键异构体组成的寡糖混合物，分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1～7个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n=0～6，乳糖除外)，糖链中主要含有β-1，3、β-1，4和β-1，6半乳糖苷键[9]。低聚半乳糖组分十分复杂，现有技术无法制备其各个组分的标准品，所以不能完成各个组分的定量检测。目前，国内外的检测方法主要有薄层色谱法[10-11]、液相色谱法[12-13]和离子色谱法[14-15]等，其中而离子色谱法因为其灵敏度高、分离度好，在低聚半乳糖检测中应用的越来越多。其中AOAC 2001.02[16]是目前应用比较广泛的测定食品中低聚半乳糖含量的方法。但是由于该方法使用酶解，通过酶解前后的差值进行计算，当样品中乳糖与低聚半乳糖的比例大于6时，测试结果存在较大误差。而婴幼儿乳粉中的乳糖含量约为50%，国产乳粉的低聚半乳糖添加量大多为0.5%～2%，所以不适用于婴幼儿乳粉中低聚半乳糖的检测。邵琪[17]和叶满香[18]使用低聚半乳糖原料作为标准品，通过乳粉基粉(未添加低聚半乳糖)和成品粉的谱图比对，选择某个特征峰作为定量峰来计算低聚半乳糖的含量。此方法中未使用标准品，在选择定量峰时有很大的主观因素，结果也不统一。

本文综合考虑以上关键问题，建立一种通过热水提取，经净化后的高效离子色谱-脉冲安培检测方法。通过方法学验证和大量实际样品测试，所建方法能够满足婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量的检测要求。

1.1 材料与试剂

3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖(CAS：100430-40-8)，量子高科；
6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖(CAS：645-03-4)，量子高科；
低聚半乳糖原料(纯度>57%，客户提供)；
乙腈(色谱纯)，上海安谱科学仪器有限公司；
50%NaOH溶液(色谱纯)，美国sigma-aldrich公司；
乙酸钠(色谱纯)，上海安谱科学仪器有限公司；
Dionex OnGuardTMⅡ RP柱，美国Thermo Fisher公司；
实验室用水为Milli-Q系统纯化水。

1.2 仪器与设备

ICS5000+离子色谱仪(配有脉冲安培检测器)，美国Thermo Fisher公司；
XS-205电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；
Centrifuge 5804高速离心机，德国Eppendorf公司；
CP2600D超声波清洗机，美国CREST公司；
XW-80A涡旋混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；
固相萃取装置，美国sigma-aldrich公司；
Milli-Q型超纯水机，美国Millipore公司。

1.3 方 法

1.3.1 标准溶液的配制

3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖和6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖标准品容量只有1 mg，采用直接溶解的方法配制标准溶液。在装有标准品的小瓶内加入1 mL水，涡旋溶解后转移至10 mL容量瓶，然后用水清洗小瓶两次并将清洗液转移至10 mL容量瓶，最终用水定容至刻度，制成浓度为100 mg/L的标准溶液。

准确称取低聚半乳糖原料(按纯度折算)10 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀后转移至玻璃瓶中，(4±4)℃保存。精密移取上述溶液适量，用水稀释成系列标准工作溶液，质量浓度分别为25、50、100、150、200 mg/L，临用现配。

1.3.2 样品处理

准确称取样品0.5 g(精确至0.001 g)于15 mL刻度离心管中，加水4 mL，振摇使溶解，60 ℃水浴超声10 min。放置室温后，加乙腈至刻度，摇匀。8 000 r/min离心2 min，取上清液1 mL，加水稀释至10 mL，摇匀，过1.0 cc OnGuardTMⅡ RP柱(先用5 mL甲醇和5 mL水活化)，弃去前3 mL溶液，取续滤液过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.3.3 色谱条件

保护柱：Dionex CarboPac PA20(30 mm×3 mm)；
色谱柱：Dionex CarboPac PA20(150 mm×3 mm)；
柱温：30 ℃；
进样量：25 μL；
流动相：A相为水，B相为200 mM NaOH溶液，C相为150 mM NaOH溶液+500 mM乙酸钠溶液，D相为100 mM乙酸钠溶液，流速和梯度洗脱程序见表1，检测器：电化学检测，金电极，标准糖电位。

表1 流速和梯度洗脱程序Table 1 Multi-step gradient and flow

2.1 定量峰的选择

低聚半乳糖的组分复杂，现有技术无法获得各个组分的标准品，况且不同厂家生产的低聚半乳糖中各组分含量也不相同，因此通过用各组分标准品来定量的方法是不现实的。随着3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖和6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖两个低聚半乳糖二糖标准品的研制成功，我们可以根据这两个标准品的保留时间来选择低聚半乳糖原料中的定量峰。结果显示，低聚半乳糖原料中6-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖组分含量较少，且色谱峰附近有干扰峰，不易定量。而3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖组分含量较高，是低聚半乳糖原料的几个主要成分之一，且色谱峰附近干扰较小，可作为定量峰来使用，见图1和图2。

图1 3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖标准品色谱图Fig.1 Chromatography of 3-O-β-D-galactopyranosyl- D-glucopyranose

图2 低聚半乳糖色谱图Fig.2 Chromatography of GOS

2.2 色谱条件的优化

选择Thermo CarbPac PA1(4 mm×250 mm)和Thermo CarbPac PA20(3 mm×150 mm)进行分离实验。结果显示，使用前者进行分离时，调整淋洗梯度也无法实现良好分离。而使用后者进行分离时，低聚半乳糖个组分峰形较好，信噪比更高。可能是PA1色谱柱柱容量小，适合分离单糖和双糖类化合物；
而PA20色谱柱的柱容量更高，在分离寡糖类化合物时灵敏度更好。通过优化淋洗梯度，定量峰与附近的色谱峰的分离度大于1.5，可满足测试的需求。

2.3 净化方法的选择

乳粉的基质较为复杂，其中的蛋白质和脂肪含量较高，进入色谱柱前最好能将其除去。实验室常用的蛋白质去除方式有乙腈沉降和亚铁氰化钾、乙酸锌等。由于我们使用的是离子交换模式，所以我们应该尽量避免离子的避免，因此选择乙腈沉降蛋白。实验初期未使用OnGuardTMⅡ RP柱进行进一步净化，实验发现测试20个样品后柱效就会有所下降，定量峰与附近色谱峰不能达到分离度1.5的要求。而在使用OnGuardTMⅡ RP柱净化后，测试50个样品后柱效未降低，且离子色谱柱价格昂贵，综合考量后使用OnGuardTMⅡ RP柱进行进一步净化。

2.4 线性关系

量取质量浓度分别为25、50、100、150、200 mg/L的系列标准工作溶液，在优化的色谱条件下进行测定，以峰面积(Y)对相对的质量浓度(X，mg/L)绘制标准曲线。结果表明，目标物的线性关系良好，相关系数(r2)为0.999，满足测试的需求。

2.5 检出限和定量限的评定

参考GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》中空白标准偏差法评估方法检出限和定量限。具体操作如下：分别在10个乳粉基粉(未添加低聚半乳糖)中加入低聚半乳糖制成含量为0.5 g/100 g的样品，按本方法进行实验，经测试后得到低聚半乳糖的含量，计算低聚半乳糖含量的3倍标准偏差即为方法检出限，10倍标准偏差为方法定量限。结果见表2，该方法的检出限为0.11 g/100 g，定量限为0.37 g/100 g。满足国家标准中要求添加量的测试需求。

表2 检出限和定量限Table 2 LOD and LOQ

2.6 回收率考察

以乳粉基粉(未添加低聚半乳糖)为样品进行加标回收实验。准确称取0.5 g(精确至0.01 g)样品，添加低聚半乳糖原料，分别制成加标水平为0.5 g/100 g、1.0 g/100 g、2.5 g/100 g的样品各6份，按本方法进行加标回收实验。由表3可见，各加标水平下的平均回收率为87.5%～100.1%，相对标准偏差为2.1%～5.4%，方法的准确度和精密度均能满足测试分析的要求。

表3 平均加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Average spiked recoveries (A.R.) and relative standard deviations

2.7 实际样品测试

应用本方法对20个市售乳粉样品进行检测，结果见表4。结果表明所有样品的检测结果均与乳粉的标示值吻合，偏差在可接受范围内，同时也反映了目前乳品企业均能按照国家要求进行生产。

表4 实际样品低聚半乳糖含量测试结果Table 4 The concentration of GOS in actual samples

本文通过对前处理过程和色谱条件进行优化，选取了低聚半乳糖原料中的3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃葡萄糖组分作为定量峰，建立了测定婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量的离子色谱-脉冲安培方法。是首次使用标准品对乳粉中低聚半乳糖进行准确定性，解决了之前方法中存在的人为选取定量峰，定性不准的问题。该方法简单快速，定量准确，经方法学验证，本方法的检出限、回收率、精密度等指标均满足检测要求，适用于婴幼儿乳粉中低聚半乳糖含量的测定，是乳企进行内部质量控制的一个很好的选择。

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