水杨酸处理对采后西兰花褪绿转黄及营养品质的影响

杨庆喜，罗曼莉，周 倩，纪淑娟

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

西兰花（BrassicaoleraceaL.var.Italica）食用部分主要为脆嫩的花茎、短缩肥嫩的花薹及紧密群集成球状的绿色花蕾。西兰花营养丰富，除了含有蛋白质、碳水化合物、VA、VC、VB1和VB2以及磷、铁、钙等无机质外，还富含硫代葡萄糖苷和萝卜硫素（sulforaphane，SFN）等生物活性物质，深受消费者青睐。然而，采后西兰花生理代谢旺盛，贮运过程和货架期间花蕾极易褪绿转黄[1-2]。Luo Feng等[2]研究发现，随货架温度的升高，西兰花褪绿转黄时间急剧缩短，室温条件下第3天便出现转黄现象。而且伴随褪绿转黄过程，西兰花中硫代葡萄糖苷等特征营养物质大量损失[2]。西兰花中主要有7 种硫代葡萄糖苷，其中，萝卜硫苷（glucoraphanin，GRA）、芸薹葡糖硫苷（glucobrassicin，GBS）和新芸薹葡糖硫苷（neoglucobrassicin，NGBS）含量最丰富，超过硫代葡萄糖苷总含量的90%[2-3]。先前的研究发现，黄化的西兰花样品中3 种硫代葡萄糖苷的含量急剧下降，下降率分别为85%、89%和23%[2]。类似的结果在Miao Huiying[4]和Kang Moku[5]等的研究中也被发现。此外，黄化西兰花中如抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、硫代葡萄糖苷的水解产物SFN及吲哚-3-甲醇（indole-3-methanol，I3C）等生物活性物质含量也明显减少[2,6-7]。褪绿转黄不仅使西兰花丧失应有的表观品质，其营养价值也大幅下降，使西兰花失去商品价值。因此，探索适宜的调控技术对于延长西兰花的保鲜期、降低其产后损失具有重要意义。

水杨酸（salicylic acid，SA），又称邻羟基苯甲酸，为一种酚类植物激素，在植物生长发育，响应冷、干旱、高盐等逆境胁迫中发挥重要的调控作用[8]。近年来，其在维持果蔬品质方面的作用已引起人们的关注。SA参与果蔬后熟衰老进程的调控。Yuan Ruimin等[9]发现，SA处理可以抑制苹果内源乙烯的合成，延缓果实的后熟衰老进程。Li Yaling等[10]指出，外源SA处理能够抑制杏果实乙烯合成关键酶的活性，介导乙烯的合成，抑制果实的软化。类似的结论在关于芒果[11]和番茄[12]的研究中也有报道。SA处理诱导果蔬抗氧化能力的提高在一些果蔬中已有报道。Zhang Huaiyu等[13]发现经SA处理的枸杞果实H2O2含量明显降低，抗氧化能力显著提升，抑制了枸杞果实的腐烂。在对芒果[14]、冬枣[15]、甜樱桃[16]和鲜切青花菜[17]的研究中也有类似报道。外源SA处理对采后西兰花的褪绿转黄进程以及营养品质的调控作用值得探讨。

鉴于SA具有保护采后果蔬品质的潜力，本实验通过观察西兰花外观颜色，测定其色差值、叶绿素（chlorophyll，chl）含量以及chl荧光的变化量，评估SA处理对采后西兰花褪绿转黄的调控作用。同时，通过分析硫代葡萄糖苷、SFN、I3C等西兰花活性营养物质含量以及抗氧化能力的变化，评估SA处理对采后西兰花营养品质的保护效果，旨在为提高西兰花采后贮运保鲜效果提供理论依据。

1.1 材料与试剂

西兰花（品种为‘耐寒优秀’）购自辽宁省沈阳市的西兰花商业种植农场。

石英砂、碳酸钙、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、钼酸铵、没食子酸、甲醇（色谱纯和分析纯）、乙腈（色谱纯和分析纯）、黑芥子硫苷标准品、SFN标准品、I3C标准品 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；
总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒 北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-400色差仪（光源D65）日本Molta公司；
CP紧密电子天平 美国Ohaus公司；
UV762紫外-可见分光光度计上海鼎科科学仪器有限公司；
LC-30A高效液相色谱系统（配备UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×0.1 m，1.7 µm））、8050液相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；
H1650R冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；
CCD-695型数码相机、FluorCam荧光成像系统北京易科泰生态技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

挑选成熟度一致（平均鲜质量0.35～0.4 kg）、无机械伤、无染病的西兰花进行实验。将预冷（4 ℃，18 h）后的西兰花随机分为两组，每组30 个花球，其中一组用SA溶液（含2%乙醇（体积分数，下同））浸泡2 min，作为处理组；
另外一组用蒸馏水（含2%乙醇）进行相同的处理，作为对照组（CK），设置3 次重复。参考Luo Manli[18]、El-Beltagi[19]和何俊瑜[20]等的研究设定SA处理浓度为2 mmol/L。自然晾干花球表面水分，然后用聚乙烯袋（50 cm×80 cm，0.04 mm）包装，每袋6 个花球，挽口存放在温度为（4.0±0.5）℃、相对湿度为78%～80%的环境中，贮存20 d。贮藏期间，每5 d取样观察，同时，按五点取样法采集花蕾组织，于液氮中快速冷冻，-80 ℃保存待测。

1.3.2 黄化指数（yellowing index，YI）和色度值的测定

通过对花球表面黄化区域的观测，参考Fang Huixin等[21]的方法对西兰花的外观进行评估。黄化的分级标准为I级：花球表现为深绿色，花蕾紧密不开花；
II级：花球表现为浅绿色，无绽放的花蕾；
III级：花球表现为黄绿色，花蕾稍微泛黄，且黄化面积小于30%；
IV级：花球表现为绿黄色，花蕾黄化面积为30%～50%；
V级：花球表现为黄色，花蕾黄化面积大于50%。YI计算参考式（1）：

借助色差仪测定样本在贮藏期间的色差值。仪器使用前利用黑白板进行校准。在正式测定时，色差仪自动生成L*（反映样品颜色的亮度）、a*（正值表示红色，负值表示绿色）和b*（正值表示黄色，负值表示蓝色）值。每个采样点从每组样品中取6 个花球，在固定的五点处测定样本的色差值，重复3 次。

1.3.3 chl荧光和chl含量测定

1.3.3.1 chl荧光测定

使用配有MC190高清数字电荷耦合相机的开放荧光相机测量样品的chl荧光。将样品放置在控制台上，使用黑色窗帘创建黑暗反应环境，以防止外界光干扰。暗处理15 min后，样品被用于测定最大PS II量子产量（maximum quantum yield，Fv/Fm）和荧光下降比（fluorescence decline ratio，Rfd）。

1.3.3.2 chl含量测定

参考Zhang Xue等[22]的方法。

1.3.4 硫代葡萄糖苷含量的测定

前期研究发现，GRA、GBS和NGBS为西兰花中主要的硫代葡萄糖苷组分，分别占硫代葡萄糖苷总量的64%、21%和7%[2]。因此，通过测定上述物质占比评估西兰花中硫代葡萄糖苷水平。

1.3.4.1 硫代葡萄糖苷的提取

参考Paulsen等[23]的方法。将0.5 g样品与4 mL体积分数70%甲醇溶液和内标物黑芥子硫苷（5 mmol/L，0.2 mL）混合，涡旋1min后置于70 ℃水浴锅中孵育30 min。随后，依次将样品进行超声提取15 min和3 000×g离心15 min，收集上清液，35 ℃旋转蒸发近干，并用1 mL蒸馏水重新悬浮。样品溶液过0.22 µm滤膜后上机检测。

1.3.4.2 硫代葡萄糖苷含量的检测

色谱分离利用高效液相色谱系统。以体积分数0.2%甲酸溶液为流动相A，色谱级乙腈为流动相B，洗脱程序如下：0～0.5 min，95% A、5% B；
0.5～3 min，95%～60% A、5%～40% B；
3～3.5 min，60%～5% A、40%～95% B；
3.5～4 min，5% A、95% B；
4～4.5 min，5%～95% A、95%～5% B；
4.5～6 min，95% A、5% B。流速0.2 mL/min；
进样量2 µL。

采用液相色谱-质谱联用仪，设定电喷雾离子源，负离子扫描多反应监测模式量化目标化合物。电喷雾源温度和去溶剂化温度分别为110 ℃和350 ℃，在3 000 V条件下进行电离。GRA、GBS和NGBS具体的质谱参数见表1。根据相对响应因子，采用内标法进行定量[2]，硫代葡萄糖苷含量计算参考式（2）：

表1 硫代葡萄糖苷的质谱参数及相对响应因子Table 1 Mass spectrometric parameters and relative response factors fordetection of glucosinolates

式中：X为目标硫代葡萄糖苷含量/（mmol/kg）；
C为目标硫代葡萄糖苷与内标物的峰面积之比；
n为内标物的添加量/mmol；
m为样品质量/kg；
f为相对响应因子。

1.3.5 SFN和I3C含量的测定

1.3.5.1 SFN和I3C的提取[1]

准确称取0.5 g样品，加入5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 7）。将混合物涡旋1 min后在37 ℃水浴锅中水解3 h。然后加入20 mL二氯甲烷，超声提取1 h。向混合体系中加入2.5 g无水硫酸镁和1 g氯化钠充分混匀，3 000×g离心5 min，收集上清液，35 ℃旋转蒸发近干，并用1 mL乙腈重新悬浮。样品溶液过0.22 µm滤膜后上机检测。

1.3.5.2 SFN和I3C的检测

高效液相色谱体系、色谱柱、流动相、检测条件和质谱参数与1.3.4节所述相同。洗脱程序如下：0～1 min，95% A、5% B；
1～2 min，95%～10% A、5%～90% B；
2～2.5 min，10%～5% A、90%～95% B；
2.5～3.5 min，5% A、9 5% B；
3.5～4 min，5%～95% A、95%～5% B；
4～5 min，95% A、5% B。流速0.2 mL/min；
进样量5 µL，主要质谱参数见表2。实验采用外标法进行定量分析，最终含量单位为mg/kg。

表2 SFN和I3C的质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters for detection of SFN and I3C

1.3.6 总酚（total phenols，TP）含量测定

参考Sun Yangyang等[24]的方法。

1.3.7 总黄酮（total flavonoids，TF）含量测定

参考魏世锦[25]的方法。

1.3.8 AsA含量的测定

参考GB 5009.86—2016《食品中抗坏血酸的测定》[26]的方法，采用2,6-二氯靛酚法测定AsA的含量，单位为g/kg。

1.3.9 T-AOC测定

利用2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸阳离子自由基法测定抗氧化能力。具体测定方法参考T-AOC检测试剂盒说明书进行，T-AOC最终单位为mmol/kg。

1.3.10 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定

参考陈双颖等[17]的方法进行MDA含量的测定，单位为µmol/kg。

1.4 数据分析

每组实验重复3 次，利用SPSS26.0软件和Tutools平台（https://www.cloudtutu.com）进行统计学分析，实验结果表示为±s。使用SPSS 26.0软件对所有数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并使用最小显著性差异法进行检验，P＜0.05表示差异显著；
P＜0.01表示差异极显著。

2.1 SA处理对采后西兰花表观变化的影响

如图1所示，4 ℃条件下随着贮藏期的延长，西兰花出现了褪绿转黄现象，CK样品于第10天出现转黄症状，随后逐渐加重，而SA处理明显推迟了西兰花褪绿转黄进程，于第20天表现出轻微的黄化症状。-a*/b*值持续下降，L*值逐渐升高，表明西兰花的绿色逐渐褪去。与CK样品相比，经SA处理的样品-a*/b*值和L*值的变化幅度明显减小，进一步验证了上述结果。YI可以反映样品的黄化程度，至贮藏末期SA处理样品的YI仅为CK组的47%。综上分析可以看出，SA处理有效缓解了采后西兰花的褪绿转黄问题。

图1 SA处理对西兰花外观变化的影响Fig.1 Effect of SA treatment on the appearance changes of broccoli

2.2 SA处理对采后西兰花chl含量和chl荧光的影响

chl含量降低是西兰花褪绿转黄的主要原因[2]。由图2可见，随着贮藏期的延长，西兰花中chla和chlb含量均明显减少，至第20天时，CK样品的chla和chlb含量分别为鲜样的27%和19%。而经SA处理的样品，chl含量下降速率明显减缓，贮藏末期chla和chlb含量的下降率分别为CK组的55%和50%。chl荧光成像系统可以用来监测西兰花chl荧光参数的变化，衡量植物的健康状况。根据西兰花的Fv/Fm值对chl荧光图像进行颜色编码，生理条件良好的西兰花颜色编码区域与浅蓝色编码区域对应，而严重发黄的西兰花呈深蓝色，图像显示CK组与处理组之间存在明显的差异。植物中Fv/Fm值的降低表明光合作用被抑制，而Rfd值越高，说明植物的健康状况越好。如图2所示，Fv/Fm和Rfd值的变化趋势相似，均随着黄化过程的发生而逐渐降低，而SA处理明显减缓了上述参数的变化，至第20天时，其下降幅度仅分别为CK组的41%和74%。这进一步验证了SA处理对采后西兰花褪绿转黄的调控作用。

图2 SA处理对西兰光合作用能力及chl含量的影响Fig.2 Effect of SA treatment on the photosynthetic ability and chlorophyll content of broccoli

2.3 SA处理对采后西兰花中硫代葡萄糖苷、SFN和I3C含量的影响

硫代葡萄糖苷是西兰花中标志性的生物活性物质，是西兰花特殊营养价值的体现。其中，GRA、GBS和NGBS为西兰花中主要的硫代葡萄糖苷组分，占硫代葡萄糖苷总量的90%以上。如图3所示，CK组中GRA、GBS和NGBS含量以及总硫代葡萄糖苷（total glucosinolate，TGL）含量均随着贮藏期的延长而呈下降趋势，尤其是GRA和GBS，至贮藏末期其含量分别减少了58%和64%。SA处理有效抑制了这种下降趋势，在整个贮藏期，GRA、GBS和NGBS含量以及TGL含量始终显著高于同期CK样品。SFN和I3C含量在整个贮藏期间均呈现先升高后降低的趋势。但值得注意的是，SA处理组中两种物质含量均显著高于CK组，尤其是SFN，其损失率不足CK组的1/10。上述结果表明，SA处理明显抑制了西兰花中特征营养物质的损失。

图3 SA处理对西兰花中硫代葡萄糖苷、SFN及I3C含量的影响Fig.3 Effect of SA treatment on glucosinolates,SFN,and I3C contents of broccoli

2.4 SA处理对采后西兰花中AsA、TP和TF含量的影响

由图4可知，两组样品在贮藏第5天后，AsA含量均呈下降趋势，但SA处理组样品AsA含量的下降速率明显减缓，至贮藏末期其下降率仅为CK组的62%。与AsA的变化趋势不同，TF和TP含量均随贮藏期的延长而呈逐渐上升趋势，而SA处理样品上升幅度更大。综上，SA处理抑制了AsA的损失，促进了TP和TF营养物质的积累。

图4 SA处理对西兰花中AsA、TP及TF含量的影响Fig.4 Effect of SA treatment on the contents of AsA,TP,and TF in broccoli

2.5 SA处理对采后西兰花抗氧化能力的影响

如图5所示，SA处理有效诱导了西兰花样品T-AOC的提高，贮藏前期，样品T-AOC快速升高，至第10天达到峰值，为同期CK组的1.8 倍，而且整个贮藏期，其水平始终显著高于CK组。MDA是膜脂过氧化的产物，其含量可以反映膜脂过氧化的程度。CK组中MDA含量随着贮藏期的延长呈快速升高趋势，至贮藏末期其含量达到鲜样的3.8 倍，而SA处理明显减缓了MDA含量的变化，第20天时，其含量仅为CK组的62%，进一步说明SA处理对西兰花抗氧化能力的诱导作用。

图5 SA处理对西兰花T-AOC及MAD含量的影响Fig.5 Effect of SA treatment on T-AOC and MDA content in broccoli

2.6 多变量统计分析

多变量统计分析可以进一步解析SA处理对西兰花采后品质的保护作用。热图作为可视化手段，能够直观地显示两个样本中各种变量的变化。如图6A所示，每一行表示不同的变量，列表示不同时期的样本；
网格的颜色越红，样本中目标变量的丰度越高；
网格越蓝则相反。处理组样品中AsA、-a*/b*、GRA、Rfd、chla、chlb、Fv/Fm、TGL和GBS等变量丰度较高。相反，L*、MDA和YI等变量在CK样本中丰度较高。此外，TP、TF及T-AOC等变量在SA10、SA15和SA20样本中显著富集。上述结果表明，SA处理有效提高西兰花的抗氧化能力，同时延缓了感官品质及特殊营养品质劣变。

图6 热图分析及PCAFig.6 Heatmap analysis and PCA

同时，选择chla、chlb、GRA、GBS、NGBS、TGL、SFN、I3C、AsA、TP、TF、T-AOC和MDA等变量进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。由图6B可知，处理组和CK组样本分列对角线两侧，有明显分离，表明SA处理介导上述变量的显著变化。进一步通过图6C识别导致两组样本存在差异的关键变量，探究SA处理对上述变量的保护作用。变量由从圆心出发的箭头表示，其投影越长，颜色越红，说明该变量对PC的贡献率更大，同时也表明该变量是导致两组样本分离的差异变量。PC1对模型的解释率为69.6%，对该PC解释率较高的变量是GRA、TGL和AsA，随后依次为MDA、chlb、chla、SFN等；
PC2对模型的解释率较低，为20.6%，对此PC解释率最高的变量为T-AOC，随后依次是TP和TF等。由此可见，SA处理对GRA、TGL和AsA的保护作用更强，且可有效诱导抗氧化能力的提高。

褪绿转黄诱发的西兰花品质劣变严重影响了其商品价值，造成产后损失。4 ℃条件下，花球于第10天表现出黄化症状，并随贮藏期的延长而加剧。伴随黄化的发生，西兰花中chl含量也急剧减少。黄化是采后西兰花快速后熟衰老的视觉表征[27]，其也可从Fv/Fm和Rfd值的降低中得到证明。外源SA处理明显推迟了衰老进程，黄化症状延晚10 d出现，同时缓解了chl的损失及Fv/Fm和Rfd值的降低，有效保护了产品品质。SA对于采后果蔬品质的保护作用在苹果、杏、番茄等果实中也有所体现[9-10,12]，因此，SA有被开发成为果蔬保鲜剂的潜力。

西兰花的褪绿转黄与其成熟及衰老过程密切相关，乙烯在此过程中发挥着重要作用。课题组前期研究证实，外源乙烯处理加快西兰花的黄化进程，而乙烯吸收剂或1-甲基环丙烯处理能够明显推迟黄化症状的出现[28]。SA作为一种酚类植物激素，在植物生长发育的调控作用已见报道[29]，Yuan Ruimin[9]和Li Yaling[10]等研究发现，外源SA处理通过调控采后苹果和杏果实内源乙烯的合成，延缓采后成熟及衰老过程，维持果实的品质。同样，外源SA处理对于果实乙烯合成的抑制作用在芒果和番茄中也有报道[11-12]，由此可以推测，SA对采后西兰花褪绿转黄的缓解作用可能归因于其对内源乙烯的调控。抗氧化能力的衰退也是采后西兰花黄化的重要诱因。伴随采后果蔬后熟衰老进程的加剧，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和清除间平衡体系被打破，导致ROS过度积累。而ROS的过量积累也会促进果蔬衰老，同时表现出chl的快速流失。先前的研究和本实验均发现，贮藏期间西兰花黄化进程与MDA水平的快速上升呈显著正相关[30]，这表明采后西兰花黄化过程中ROS过量积累，加重了膜脂过氧化引发的膜损伤。本研究发现，CK组中chla和chlb含量显著减少，T-AOC急剧降低，而SA处理则提高了西兰花的T-AOC，维持了较高的chl水平。同时，处理组中MDA含量变化相对稳定。这些结果表明SA处理延缓西兰花褪绿转黄可能与其在减轻脂质过氧化方面扮演积极角色有关。此外，Zhang Huaiyu[13]和Sang Yueying[15]等研究发现经SA处理的枸杞和大枣果实其抗氧化能力显著增加。本研究发现处理组样本积累了更高水平的AsA、TP及TF等抗氧化物质，证明SA处理对于果蔬抗氧化能力具有诱导作用。因此，上述结果表明，SA处理可延缓采后西兰花衰老进程，更好的维持西兰花的品质。

西兰花褪绿转黄的同时伴随营养品质的急剧降低，特别是其特征营养物质GRA、GBS、SFN和I3C，其变化趋势与黄化进程呈正相关。本研究发现，CK组中GRA和GBS含量大幅下降，损失率均超过50%，这与先前的研究结果[4-5]类似。SFN和I3C均可调控细胞防御系统，提高机体解毒和抗氧化能力[1]，其在黄化过程中损失率约为60%。类似的结果在Pintos等[31]的研究中也被发现。值得注意的是，外源SA处理明显减缓了上述营养成分的流失速率，在整个贮藏期，上述物质损失率均不足35%，尤其是SFN（损失率小于5%）。同时，SA处理对于西兰花营养品质的保护作用还体现在CK组中积累了更多的AsA、TP和TF。这些结果表明，SA处理有效阻止了采后西兰花营养品质的下降。通过PCA发现，SA处理对于GRA的保护作用更强。然而，关于外源SA处理调控采后果蔬营养品质的研究相对较少。目前研究发现，ROS胁迫可能促使植物细胞合成更多的初级硫代谢物，进而限制GRA（次级硫代谢物）的合成，甚至诱导GRA的降解[32-33]。此外，细胞内高氧化水平亦可直接抑制硫代葡萄糖苷的生物合成，表现为ROS信号通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径调控R2R3-MYB（myeloblastosis）家族转录因子（MYB28/29/34/51）的转录，其中MYB28为调控GRA合成的关键因子[34]。因此，SA处理对于GRA的保护作用可能归因于对抗氧化能力的增强，具体的证据仍需进一步探究。

SA处理明显推迟了西兰花褪绿转黄进程，延缓了营养品质劣变。结果表明，用SA处理的样品保持了更高的chl含量，表现出更高的Fv/Fm和Rfd值及较低的YI。此外，处理组样本中GRA、GBS、SFN、I3C、AsA、TP和TF丰度更高，表明SA处理保护了采后西兰花的营养品质。同时，SA处理提高了采后西兰花的抗氧化能力，抑制了MDA含量的快速上升。因此，对采后西兰花进行SA处理可能是改善其品质劣变的有效策略。

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