赵亚菲,姚 远,钟克利,2,*,孙小飞,李学鹏,汤立军,2,励建荣,*
(1.渤海大学化学与材料工程学院,辽宁 锦州 121013;
2.渤海大学海洋研究院,辽宁 锦州 121013;
3.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁 锦州 121013;
4.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁 锦州 121013)
鱼肉具有补充营养、调节血脂、改善皮肤状态等功效,是餐桌上不可或缺的美食[1]。在众多鱼类中,三文鱼具有肉质鲜美、脂肪含量低、富含多种微量元素[2-4]等优点,被誉为“水中珍品”。我国三文鱼多数以进口为主,需要长时间运输和贮藏才能送达消费者手中,鱼肉长时间贮藏会使微生物大量生长,其不断分解蛋白质,产生异味[5],消费者误食不新鲜的鱼肉后会给身体带来损害,如引起肠胃不适、呕吐腹泻,严重的可以造成食物中毒,危及生命[6]。因此,检测三文鱼的新鲜度具有重要意义。
鱼肉新鲜度传统评价方法主要有气相色谱法[7-9]、高效液相色谱-质谱法[10]、电化学法[11]等,然而,这些方法涉及大型仪器、操作复杂、耗时费力[12-14]、不适合实时监测[15],因此,开发快速、可视化实时检测鱼肉新鲜度的方法十分必要[16-17]。目前,比色法可以直观评价鱼肉新鲜度,如2020年本课题组以溴酚红和溴甲酚紫为指示剂制备了一种指示标签,通过标签对鱼肉样品总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量的敏感度变化评价鱼肉的鲜度[18]。当指示标签的内圈和外圈颜色均变为深紫色,表明鱼肉已经腐败;
2022年,Ding Nan等[19]探索了一种基于银掺杂普鲁士蓝纳米颗粒的比色探针,用于检测三甲胺和虾/鱼的新鲜度,当探针颜色由蓝色变为无色,表明鱼肉已腐败;
2023年,Said等[20]将姜黄素与明胶复合制备的比色膜用于鱼片的新鲜度检测,膜的颜色由黄色变为橙红色,表明鱼肉由新鲜变为腐败。可见,这种简单、经济、无损的比色探针在鱼肉鲜度指示方面具有一定的应用前景。但是,已报道的比色探针中也存在颜色变化不显著,鱼肉在合格与腐败之间可视化区分不明显,进而导致品质误判的情况发生,因此,需要开发新方法弥补单通道比色法的不足。
荧光法由于灵敏度高、选择性好等优点已经成为检测生物活性分子的有效方法之一[21-25]。将荧光法与比色法结合,开发对挥发胺比色和荧光双响应的探针对鱼肉新鲜度双通道指示,可提升评价结果的准确性。2022年,Liu Xiuying等[26]开发了一种检测三文鱼新鲜度的比率荧光传感标签,当标签颜色从粉色变为深蓝色,荧光由粉红色变为蓝色,表明三文鱼鱼肉由新鲜变为腐败,双通道颜色明显变化可准确辨别鱼肉所处鲜度等级。2023年,Zhang Jin等[27]基于间苯二酚开发了一种双通道智能标签,当标签颜色从无色到粉红色,并伴有强烈的红色荧光时,表明鱼虾由新鲜变为腐败,这种标签在实时显示新鲜度方面具有较好的应用潜力。可见,开发能够比色和对胺敏感的荧光探针,可构建新鲜度双通道指示标签,其具有更好的应用前景[28-29]。
本研究旨在构建一种新颖的荧光探针萘酚-苯并噻唑衍生物(naphthol-benzothiazole derivative,HBO),利用该分子中酚羟基具有给电子性质,苯并噻唑磺酸盐具有吸电子性质,通过双键连接后形成给体-π-受体结构,这种延长的共轭体系可使HBO的发射波长增大,同时磺酸盐还可增加HBO的水溶性。此外,HBO中萘环上的酚羟基具有酸性,可以与鱼肉腐败过程中产生的多数胺发生反应,失去氢质子后,形成的氧负离子具有更好的给电子能力,使分子内电荷转移更容易发生,因此,HBO识别胺后会表现出明显的颜色和荧光变化。最后,以凝胶为固体载体,通过混合法制备负载荧光探针HBO的传感凝胶用于鱼肉新鲜度检测,以期为荧光探针在食品检测领域应用提供科学依据。
冰鲜三文鱼购于锦州市林西路水产市场,平均质量(2 500±50)g。
6-羟基-2-萘醛、2-甲基苯并噻唑、琼脂糖、氧化镁、哌啶购自上海安耐吉化学有限公司,无需纯化直接使用;
化合物4a按照文献[30]合成;
实验用水均为去离子水;
其他所用试剂均购自天津永大公司。
JY1200电子天平 德国赛多利斯科学仪器有限公司;
RE-2000旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;
FSH-2高速均质机 上海仪电科学仪器股份有限公司;
Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 上海浦予工业科技有限公司;
400 MH核磁共振仪 美国安捷伦科技有限公司;
F-4700荧光分光光度计 郑州今时迈科技有限公司;
U-T1810DS紫外分光光度计 上海屹谱仪器制造有限公司。
1.3.1 探针HBO的合成
向圆底烧瓶中加入化合物4 a(406.5 mg,1.5 mmol)、6-羟基-2-萘甲醛(172 mg,1 mmol)无水乙醇(5 mL)和0.08 mL哌啶,回流过夜。将析出的固体过滤,用冰乙醇洗涤3 次,得到棕黄色固体HBO(310 mg,73%)。1H NMR(400 MHz,氘代二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide-d6,DMSO-d6))δ10.31(s,1H),8.46~8.21(m,6H),7.91~7.77(m,4H),7.22~7.17(m,2H),5.12(t,J=8.0 Hz,2H),2.69~2.67(m,2H),2.23(s,2H)。高分辨质谱(正离子模式),分子式C22H19NO4S2[M+H]+,计算值:426.082 8,实测值:426.083 9。探针HBO的合成和传感凝胶HBO琼脂糖凝胶(HBO agarose gel,HBOAL)的制备方法如图1所示。
图1 探针HBO和传感凝胶HBOAL的制备方法Fig.1 Preparation methods for HBO and HBOAL
1.3.2 胺溶液的配制
测试所用不同胺溶液均用蒸馏水配制成50 mmol/L,以异丙胺为例,取异丙胺29.5 mg,振荡溶解后定容至10 mL容量瓶,即为50 mmol/L的异丙胺溶液。其他胺溶液(环己二胺、二乙胺、正丙胺、异丙胺、三乙胺、乙胺、精胺、尸胺、腐胺、2-苯乙胺、酪胺、色胺)用相同方法配制,测试所用其他浓度用蒸馏水稀释即可。
1.3.3 探针HBO溶液的配制
称量4.3 mg HBO固体,用DMSO溶解并定容到10 mL容量瓶中,即得到所需的1 mmol/L的HBO储备液,吸取1 mL至100 mL容量瓶中,用EtOH/H2O(1∶9,V/V)的混合溶液定容于100 mL,得到浓度为10 μmol/L的HBO溶液,用于测试。荧光测试的激发和发射狭缝宽度均为5 nm,电压为700 V,激发波长为430 nm。
1.3.4 传感凝胶HBOAL的制备
将0.3 g琼脂糖溶解于15 mL蒸馏水中,加入0.2 mL甘油,将混合溶液在搅拌下加热至澄清透明,冷却至60 ℃时,将0.01 g HBO固体用2 滴DMSO溶解后,迅速加入到琼脂糖溶液中,继续搅拌至混合均匀,然后将混合液快速倒入直径为9 cm的培养皿中,气泡用玻璃棒赶至培养皿边缘,用滴管吸出。琼脂糖溶液冷却至室温后凝固成块,将其分割成直径为1 cm的传感凝胶HBOAL,用于后续实验。
1.3.5 鱼肉样品TVB-N和pH值的测定
室温条件下将5 g鱼肉样品用绞肉机绞碎,加入35 mL蒸馏水,用均质机进行均质5 min。静置30 min后过滤,取其上层清液用全自动凯氏定氮仪测定TVB-N值,用pH计测定pH值,所有操作重复3 次。
1.3.6 传感凝胶HBOAL对鱼肉新鲜度的检测
购买的冰鲜三文鱼快速转运至实验室,去除三文鱼表皮,将鱼肉切成质量为10 g的测试样品,放入一次性培养皿中,用带孔的薄膜密封,将传感标签HBOAL置于孔隙处,盖上顶盖并用皮筋固定。在4 ℃条件下贮藏,每隔24 h取出鱼肉样品测试其TVB-N值、pH值,并拍照记录传感凝胶的颜色。
每组实验设置3 个平行,使用Origin 2021软件绘图,采用华为Nova7拍摄照片。
为了探究HBO对不同胺是否有比色和荧光响应,进行紫外-可见和荧光光谱测试。紫外吸收光谱如图2a所示,探针HBO(10 μmol/L)的EtOH/H2O(1∶9,V/V)溶液在425 nm波长处出现强吸收,向HBO溶液中加入不同胺溶液后,最大吸收峰红移至535 nm,溶液颜色由浅黄色变为粉色(图3a)。在430 nm波长的激发下,探针HBO溶液(10 μmol/L)在605 nm波长处有微弱荧光,向HBO溶液中加入不同胺溶液后,在545 nm波长处均表现出一定程度的荧光增强且发射峰蓝移(图2b),伴随着荧光颜色由弱荧光变为不同颜色的强荧光(图3b),这些结果表明,探针HBO对不同胺溶液有较好的比色和荧光响应。
图2 探针HBO(10 μmol/L)的EtOH/H2O(1∶9,V/V)溶液加入不同胺溶液的紫外吸收光谱(a)和荧光光谱(b)Fig.2 UV absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution added with different amine solutions
图3 HBO溶液中加入不同胺溶液后的颜色变化Fig.3 Color changes of HBO solution after adding different amine solutions
如图4a 所示,在pH 5~7 范围内,HBO 溶液(10 μmol/L)在430 nm波长处的吸光度变化不大,而pH值由8增大至10时,最大吸收波长变为505 nm,且吸收强度不断增强。HBO溶液的荧光强度(595 nm)在pH 5~10范围内不断减弱(图4b),在pH 5~7范围内减弱程度相对较小,结合紫外吸收谱图,pH值在5~7范围内HBO受pH值影响较小,说明探针HBO在只能在微酸性条件下使用。
图4 HBO(10 μmol/L)的EtOH/H2O(1∶9,V/V)溶液在不同pH值条件下的紫外吸收光谱(a)和荧光光谱(b)Fig.4 UV absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution at different pH conditions
如图5a所示,向HBO溶液(10 μmol/L)中加入不同浓度(0~250 μmol/L)的精胺,HBO溶液的荧光强度逐渐增强,并且荧光强度与精胺浓度在40~240 μmol/L范围内有较好的线性关系(R2=0.994,图5a内插图),利用公式(检出限(limit of detection,LOD)=3S/K(S为空白样的标准偏差;
K为荧光强度与精胺浓度线性关系的斜率))计算出HBO的LOD为0.4 μmol/L,表明HBO检测精胺具有较好的灵敏度。另外,向HBO溶液(10 μmol/L)中加入250 μmol/L的精胺,其荧光强度(545 nm波长处)随时间的变化结果如图5b所示。随着时间的延长,HBO荧光发射强度逐渐增强,在75 s后达到平衡,说明HBO对胺有较快的识别响应速率,为实现快速实时检测鱼肉新鲜度奠定了基础。
图5 HBO(10 μmol/L)的EtOH/H2O(1∶9,V/V)溶液识别精胺的灵敏度及响应时间Fig.5 Sensitivity and response time of spermine recognition by HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution
将不同浓度(1、5、10、30、50 μmol/L)的HBO溶液与MCF-7细胞共同培育24 h后,即使HBO浓度为30 μmol/L时,细胞成活率仍接近80%,说明HBO具有较低的毒性(图6a),可应用到生物体系中。将MCF-7细胞与HBO共同孵育30 min后,向其中加入不同浓度的精胺(100、200、500 μmol/L),在37 ℃条件下继续孵育30 min,随着精胺浓度的增加,在红色及绿色通道中可观察到荧光强度均逐渐增强(图6b),表明探针HBO能够穿透细胞膜,在细胞中对胺化合物进行荧光成像。
图6 HBO的细胞毒性及其在活细胞中对精胺的荧光成像Fig.6 Cytotoxicity of HBO and its fluorescence images in living cells exposed to spermine
根据GB/T 18108—2019《鲜海水鱼通则》规定,海水鱼中TVB-N最高限量为30 mg/100 g。当样品TVB-N值≤15 mg/100 g时为优级,15 mg/100 g<TVB-N值≤30.0 mg/100 g时为合格,TVB-N值>30.0 mg/100 g时为不合格。为了探究传感凝胶HBOAL的颜色与三文鱼新鲜度之间的对应关系,将HBOAL与三文鱼鱼肉在4 ℃贮藏,测定TVB-N值和pH值,结果如图7a所示。随着时间的延长,pH值呈现先降低后升高的趋势,符合鱼肉微生物分解劣变趋势。TVB-N值从起始的(7.00±0.06)mg/100 g整体呈上升趋势,在第4天达到(15.10±1.20)mg/100 g,表明此时鱼肉样品合格;
在第8天达到(30.30±0.06)mg/100 g,表明此时鱼肉样品已腐败。同时,记录HBOAL在不同时间的颜色变化,结果如图7b所示。当鱼肉新鲜时,传感凝胶日光颜色为暗粉色,荧光颜色为蓝色。第4~7天鱼肉处于合格状态时,HBOAL的日光颜色变为浅粉色,荧光颜色变为绿色。第8天后鱼肉腐败,HBOAL日光颜色变为浅红色,荧光颜色为黄色,由此建立了HBOAL颜色与三文鱼鱼肉新鲜度之间的对应关系。
图7 4 ℃贮藏条件下三文鱼鱼肉的pH值和TVB-N值随贮藏时间的变化(a)及HBOAL在日光和荧光下的颜色随贮藏时间的变化(b)Fig.7 Changes in TVB-N and pH of salmon fish with storage time (a),and changes in HBOAL color under daylight and fluorescence (b) during storage at 4 ℃
最后,根据三文鱼新鲜度与传感凝胶HBOAL颜色之间的对应关系,制作了标准比色卡(图8)。将HBOAL与鱼肉4 ℃条件下共同贮藏,监测HBOAL颜色变化,并根据标准比色卡判断鱼肉的新鲜程度等级,结果如图9所示。HBOAL在日光下为暗粉色,在荧光下为蓝色时,表明三文鱼肉为新鲜状态;
HBOAL在日光下为浅粉色,在荧光下为绿色荧光时,表明三文鱼肉处于合格状态;
HBOAL在日光下变成浅红色,在荧光下变成黄色时说明三文鱼肉已腐败,这些结果表明HBOAL可通过日光和荧光双通道响应,准确判断三文鱼鱼肉所处的鲜度等级。消费者可根据HBOAL的变色情况及时判断鱼肉的新鲜程度,在生鲜、肉类市场具有较好的应用潜力,同时也为食品智能标签的研究提供一定的理论参考依据。
图8 传感凝胶HBOAL的标准比色卡Fig.8 Standard colorimetric cards of HBOAL
图9 4 ℃贮藏条件下传感凝胶HBOAL监测三文鱼鱼肉新鲜度的颜色变化及评定的鲜度等级Fig.9 Monitoring of color changes indicating salmon freshness and freshness classification by HBOAL under 4 ℃ storage condition
本研究基于萘酚合成的荧光探针HBO在EtOH/H2O(1∶9,V/V)体系中可对12 种胺快速响应(75 s),对精胺有较低的LOD(0.4 μmol/L),并可在活细胞中对精胺进行荧光成像。基于HBO构建的传感凝胶成功应用于三文鱼鱼肉新鲜度的检测,HBOAL在日光下由暗粉色变成浅红色,在荧光下由绿荧光变成黄荧光,表明鱼肉由新鲜变为腐败,实现了比色和荧光双通道指示。这种无损、双通道可视化判定鱼肉鲜度等级的方法可为商家和消费者提供及时有效的新鲜度信息,具有较好的应用前景。
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