生鲜乳中黄曲霉M1胶体金法的推广研究

文│杜春雷 （河北省张家口市农产品质量安全监督检验中心）

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是一类结构包括二呋喃环和香豆素的化合物。黄曲霉毒素可以在长波紫外光照射下产生荧光反应，依据其荧光颜色、RF值高低及化学结构的不同，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、R1、GM和毒醇。

黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是一类哺乳动物因采食黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在其机体内羟基化产生的有毒代谢转化产物，世界卫生组织（WHO）已将其列为ⅡB类致癌物。黄曲霉毒素M1进入人体或其他哺乳动物有机体内后显著抑制肝组织蛋白质的正常合成，导致肝中毒，表现为损害肝组织；
致癌、致畸、致突变，引发多种肝病，进一步诱发肝癌等，毒性是砒霜毒性的近70倍。

生鲜乳中黄曲霉毒素超标，一是产品长期储存方法不当，或原料、产品在二次加工、运输储存过程中受到污染所致；
二是养殖户把那些长了霉菌的粮谷当作动物的饲料，其中会含有极大量的黄曲霉毒素，这些毒素会在24小时后代谢富集转移到奶中。黄曲霉毒素被哺乳动物直接采食后，一部分会残留在动物体内，另一部分会释放到哺乳动物的乳汁和尿液中。

黄曲霉毒素M1一旦形成难以消除，因为黄曲霉毒素M1对光热和酸特别稳定，裂解温度将近300℃，生鲜乳常见的消毒方式均不能将其完全消除。

目前，世界已有很多国家，包括亚洲、欧洲等均对黄曲霉毒素M1的含量制定了严格的国家国际限量指标。我国发布的国标《食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）中明确规定黄曲霉毒素M1在乳及乳制品中的残留限量为0.5微克/千克。

黄曲霉毒素的检测方法一般分为两类：一类是基于气相色谱或液相色谱分离技术的各种物理化学分析方法，包括薄层层析法（TLC）、高压液相色谱法（HPLC）、液相色谱-联用质谱检测法（LC-MS）；
另一类是免疫化学分析检测方法，包括酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金法。

1.薄层层析法（TLC）。薄层层析法（TLC）是一项最初用来测定黄曲霉毒素的试验方法，基本原理是将待测样品提取、层析、洗脱、浓缩和分离，然后在波长365纳米的紫外光下产生特殊荧光，最终即可计算出黄曲霉毒素的含量，如GB 5009.22-2016的第五法薄层色谱法，检出限5微克/千克，但存在灵敏度低、污染大、干扰因素多等缺点，更多用于黄曲霉毒素样品的初步筛查和定性判断。

2.液相色谱法（HPLC）。液相色谱法（HPLC）的基本原理是样品中多种化合物在色谱柱的流动相和固定相之间有不同程度的吸附，从而实现目标物的分离。再通过柱后电化学衍生作用后释放产生特征荧光，通过紫外荧光检测器检测进行定性和定量。具有高分辨率、分析时间较短等优点，如GB 5009.22-2016的第三代高效液相色谱-柱后衍生法，检出限0.003～0.03微克/千克，但需要昂贵的仪器设备，较高的分析技术。

3.液相色谱-联用质谱法（LCMS）。液相色谱-联用质谱法（LCMS）基本原理是将待测样品中的M1和M2用甲醇-水溶液进行提取，再用水或磷酸盐缓冲液进行稀释，经过免疫亲和柱净化，氮吹浓缩、用流动相定容和过针式滤膜后上液相色谱分离，质谱仪进行分析检测，内标法定量。液相色谱-联用质谱法（LCMS）具有前处理操作简单、检测速度快、灵敏度响应高，能满足大批量样品检测等优点，但对检测仪器和操作人员的技术要求较高。

4.酶联免疫吸附法（ELISA）。

酶联免疫法（ELISA）是抗原（或抗体）吸附剂和用酶标记的抗体（或抗原）与标本中的目标物发生特异的免疫学结合反应，通过测定相应酶活力的方法进行定性或定量的技术方法。主要包括双抗体夹心法和竞争法两种试验方法。酶联免疫吸附法具有所用试剂少、操作简便、快捷，如GB 5009.22-2016中第五法酶联免疫吸附筛查法，检出限1微克/千克，具有适合大批量样品筛查的主要优点。

5.胶体金法。胶体金法基于竞争免疫技术，将待测样品提取液滴加到速测卡的样品孔中，提取液中的M1和速测卡上的抗体结合产生复合抗体化合物，如果提取液中M1浓度比检测灵敏度低，没有结合的抗体会转移到T区，被膜上相应的抗原捕获，形成一条肉眼可见的T线；
如果提取液中M1浓度比检测灵敏度高，抗体就不会和T线处的抗原结合，T线自然就消失不见。C线是一条质控线，出现才能证明速测卡的有效性。该方法方便快捷，特别适合现场快速检测。

孙翠萍等用胶体金标记黄曲霉毒素M1抗体，获得了一种灵敏度为0.3纳克/毫克的胶体金免疫标记快速检测试纸条，检测时间仅需l0分钟，并对10份牛奶样品进行了黄曲霉毒素M1检测，其检测值与ELISA（酶联免疫吸附测定）检测值一致，表明在黄曲霉毒素M1快速现场筛中是一种不错的选择。

1.张家口地区奶业现状。张家口市位于内蒙古高原的最南端，北方农牧交错带，总面积3.7万余平方千米，饲草资源较为丰富，畜牧家禽养殖历史悠久，2003年被农业农村部列为全国7个奶业发展优势产业带，发展成为河北省四大奶牛优势产区之一。特别是近几年在市委、市政府正确领导下，畜牧养殖业已成为张家口市调整农业产业结构、转变经济增长方式和增加农民收入的主导产业。至2021年底，年内存栏26.59万头，生鲜乳产量121万吨，存栏和奶产量位居全省第二。全市有蒙牛、伊利、君乐宝、长城乳业等乳品加工企业11家，年实际处理生鲜乳95.2万吨左右。

2023年作为张家口市奶业振兴的关键之年，全市奶业振兴的总体思路是以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导，全面贯彻落实中央、省关于畜牧业发展的决策部署，以奶产业建设为主线，立足“首都两区”功能定位，围绕以水定产、以水定畜总要求，以乡村振兴战略为统领，以特色农牧产业发展为依托，应变局、开新局，坚持稳中求进、整链推进，强化利益联结、引导乳品消费，建设百亿级奶业工程，提升全产业链竞争力，全市奶牛存栏、生鲜乳产量、乳制品产量分别达到29万头、116万吨和77万吨，奶业全产业链产值105亿元，为群众乳制品消费和乡村振兴提供保障和支撑。

众多优势使张家口乳业前景十分乐观，但鲜奶质量安全问题依旧是重中之重。目前张家口生鲜乳由于受养殖加工方式落后、科学技术投入较少等因素的影响，质量安全令人担忧。同时张家口市缺少大气、水源、土壤等环境监测，不能更全面地保证农业及产品的环境和质量安全。

2.采用胶体金法检测的必要性。现场快速检测技术是保障乳制品质量安全的核心手段。现有各种大型仪器检测技术却因为操作过程复杂、需要昂贵精密仪器和专业分析技术人员难以满足现场快速检测的需求，各检测方法对比详见表1。

表1 检测方法对比表

薄层色谱法的操作过程烦琐、污染干扰大、耗时较长；
液相色谱法和液相质谱法结果虽然可靠准确，但前处理过程复杂，需要大型精密仪器，对人员操作和分析要求较高；
酶联免疫法用时较短，但也需要酶标仪和操作熟练的技术人员，同样不适合现场快速检测；
胶体金法检测时间短、操作过程简单、无需其他仪器设备、结果直观容易判别，完美满足现场快速检测的要求。

在张家口市各县区推广生鲜乳中黄曲霉M1快速筛查胶体金法，涉及现代牧场、规模养殖场、奶农专业合作社和乳品加工企业15家以上，覆盖奶牛3万头以上，在生产运输环节进行生鲜乳抽样检测，并形成完善的养殖、抽样档案记录，生鲜乳抽样检测覆盖在1万吨以上。采用此方法的生产主体可节省较大的时间、人力、物力成本。主要表现在以下几个方面。

（1）经济效益。与实验室检测相比，企业、养殖主体采用胶体金免疫层析法可节省实验室高效液相色谱仪采购费用约40万元，每批次检测可节省成本约3000元。胶体金免疫层析法对温度环境容忍度较高，相比一般快速检测手段可节省便携冷藏设备约2000元。

（2）生产效益。与实验室液相色谱法相比，胶体金免疫层析法操作简单，可极大降低检测技术人员的培训成本，每批次检测时间从2小时压缩至10分钟左右，极大提升了生产、存储、运输各环节的流通效率。

（3）社会效益。胶体金免疫层析法成本低、灵敏度高、反应快速，依托对该方法的研究与总结，对保障生鲜乳和乳制品的质量安全以及消费者健康安全具有非常重大的意义。

生鲜乳作为一种保鲜期短，不宜长途运输的食品，建立生鲜乳和乳制品中黄曲霉毒素M1快速检测技术，推广胶体金法对保障生鲜乳、乳制品的质量安全和消费者的健康安全具有非常重大的意义。胶体金法具有灵敏快速、操作过程简单、不需要使用其他试剂和大型精密仪器等多个优点，大大提高了现场检测效率，满足现场对快速准确检测的需求。现场快速检测可以作为行政执法依据，还可以提高行政监管的效率和力度。对发现检测超标有问题的样品进一步送往实验室进行复检，达到提高检测检验和监督执法的效率，实现现场快速检测与实验室精准检测的高效互补，对保障生鲜乳的质量安全极为重要。

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