基于网络药理学及分子对接探讨二至丸对非小细胞肺癌的作用机制*

李若尘 ,田 津,汪鸣霄,3,周 洵,3▲

(1贵州中医药大学,贵州 贵阳 550003;2贵州中医药大学 第二附属医院,贵州 贵阳 550003;3朱祝生全国名老中医药专家传承工作室,贵州 贵阳 550003)

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1],其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中的最为常见的类型,约占肺癌总数的85%[2],非小细胞肺癌转移早,五年存活率仅有8%～15%[3]。在未来的一段时间,肺癌的发病率仍处于患者数量大、发病率持续上升的趋势[4]。目前治疗本病的化疗药物主要有铂类,铂类中较为常见的药物如顺铂治疗本病会出现骨髓抑制、肾毒性等不良反应,而中药有着多成分、多靶点、多途径、副作用小的特点。有研究表明,中医综合治疗晚期NSCLC的疗效与化疗方案相比,在延长生命方面疗效无明显差异,采用中医综合治疗方案的患者不良反应明显少于化疗组,且生存质量较高[5]。

网络药理学是近年来兴起的一门桥梁学科,网络药理学与多个学科紧密联系,具有整体性、系统性的优势,这与中医整体观念和辨证论治的观点一致。其次,网络药理学分析法建立在“疾病-基因-靶点-药物”网络的基础上,从中药多成分、多靶点、多途径的特点着手分析,故能够从整体上观察药物对疾病的影响,因此,对中药复方进行网络药理学分析能够有效传承发扬中医理论,为后期深入研究及研发新型抗非小细胞肺癌的药物提供思路。

祖国医学无“非小细胞肺癌”病名,祖国医学将本病列为“肺积、咳嗽、咯血”等病范畴,研究表明,阴虚是非小细胞肺癌患者的常见临床分型,在TMN分期中,阴虚是I期、III期、IV期中的重要病性证素[3]。传统观点认为,肺癌属于“毒热”之邪,毒热之邪煎灼津液,导致津液耗伤,日久伤及阴液,出现干咳、口干、痰中带血、咽干、胸痛、盗汗、舌红少苔等阴虚症状。另有观点认为,放疗、化疗后,毒热之邪可加重阴津耗伤,加重阴虚证表现[6]。二至丸出自明代吴旻《扶寿精方》[7],本方由墨旱莲、女贞子组成,具有补益肝肾、滋阴止血的功效[8],本方被誉为“清上补下第一方”。墨旱莲、女贞子均归肝、肾二经,二者均能滋补肝肾。墨旱莲味甘性寒,长于滋养肝肾之阴,又可凉血止血,故可用于治疗阴虚血热之咯血、吐血等症;女贞子味甘性凉,补中有清,二者合用,共奏补益肝肾、滋阴止血之功。贵州中医药大学朱祝生教授认为,肝肾同源,肝肾两脏阴液相互滋生,肝阴充足,则下藏于肾,肾阴充裕,则向上滋养肝木,当肝肾之间的平衡被打破,会出现水不涵木、肝阳上亢的症状,肝阳上亢,上升于头目,则头晕目眩,肾阴不足,则耳鸣,阴虚腰膝不能荣养,则腰膝酸软,阴虚则阳失去制约,虚热上扰,在于口咽,则口干、咽干,在于四肢,则手脚心发热,虚热郁蒸营阴,则夜间汗出,肝肾阴亏,在于女子,则冲任失调,月经量少,虚热在舌,则见舌红少苔。朱祝生教授善使本方用于治疗阴虚证型肺积病,临床上多与其他经方加减合用,疗效更佳。

据文献报道,二至丸对多种肿瘤有抑制作用[9-11],因而广泛应用于临床,因非小细胞肺癌会有阴虚表现,且本方有止血之功,故比较适用于罹患非小细胞肺癌合并阴虚咯血症状的患者。现代研究表明,二至丸可以通过调节T细胞、NK细胞、肿瘤坏死因子等方面调节人体免疫状态[10]。现代药理研究证实,墨旱莲有黄酮类成分、三萜皂苷类、香豆素类成分[12]等,其中,皂苷类成分具有抗肿瘤作用[13]。A549细胞(肺癌人类肺泡基底上皮细胞)是常见的人肺癌细胞,蟛蜞菊内酯可诱导肺癌A549细胞凋亡,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活有关[14]。对女贞子的研究发现,女贞子具有明确抗肿瘤的药理作用[15],女贞子中含有的齐墩果酸具有提高免疫力的作用,主要成分为齐墩果酸的扶正女贞片具有增强肿瘤患者淋巴细胞、巨噬细胞功能的作用,本品有着较高的安全性,疗效佳,副作用少,是一种较理想的免疫调节药物[16]。

1.1 二至丸相关靶点筛选

利用TCMSP数据库对墨旱莲、女贞子活性成分进行收集,OB值越高代表药物吸收越好,DL值越高代表化学成分的类药性越强,故将药物的OB值取大于或等于30%,DL值取大于或等于0.18,获得活性化合物及蛋白质靶点,筛选完成后将药物的蛋白质靶点与Uniprot数据库进行规范。

1.2 NSCLC疾病靶点收集

以“non-small cell lung cancer”为关键检索词条,从Genecards、OMIM数据库获取NSCLC疾病重要靶点,并从Drugbank数据库获取临床用药靶点,将获得的NSCLC靶点合并,并去除重复值。

1.3 构建PPI

使用venny2.1.0对筛选的疾病靶点及药物靶点取交集并获得韦恩图,将共有靶点输入String数据库,将物种设置为人类(Homo sapiens),将置信度设置为0.900,其余设置按系统默认。

1.4 药物-成分-靶点网络图构建

使用Cytoscape3.7.1构建二至丸成分-NSCLC靶点,并使用内置工具对网络图进行分析,根据度值(Degree)大小将活性化合物排序,绘制网络图。

1.5 靶点的通路分析

利用Cytoscape3.7.1分析网络,筛选Degree值排名前5的活性化学成分,利用R语言对活性成分进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,输出结果并绘制气泡图。

1.6 分析对接

从PubChem数据库获取Degree值较高的格式为pdbqt的小分子配体二维结构,使用Chem3D软件将其转化为三维立体结构,并按照最小自由能对分子结构进行优化,获得最稳定的分子结构,而后于PDB蛋白数据库获取pdb格式的受体结构,通过pymol软件进行加氢优化,最后通过AutoDock Vina进行检验。

2.1 活性化合物的筛选

二至丸筛选获得21个活性成分,其中,墨旱莲筛选得到槲皮素、木犀草素、蟛蜞菊内酯、红车轴草素等10个符合ADME筛选标准的有效活性成分,女贞子获得β-谷甾醇、山奈酚等13个符合ADME筛选标准的活性成分,经核对发现,槲皮素、木犀草素是二者的共同成分。通过uniprot数据库对靶点名称进行规范处理,墨旱莲获得178个非重复药物靶点,女贞子获取得196个非重复药物靶点,将二者合并除重后,共获得205个非重复药物靶点。

2.2 疾病靶点的获取

以“non-small cell lung cancer”为关键检索词条,从OMIM数据库获得469个符合条件的NSCLC疾病靶点;从Genecards数据库获得7365个疾病靶点,收集排名前1500的重要靶点;以临床常用药物作为补充,从DrugBank数据库获得疾病靶点52个,将以上数据库中的靶点进行去重,共获得1935个疾病靶点。

2.3 二至丸、NSCLC交集靶点的获取

将二至丸非重复药物靶点及NSCLC靶点输入venny2.1.0,将药物靶点和疾病靶点取交集,二者获得132个共同靶点。

2.4 PPI的构建

PPI中共有节点126个,获得615条边,节点连线数量越多,代表节点在网络中越重要,得出蛋白互作网络图(图1)。将所获得的交集基因导入String网络平台中构建PPI,并提取核心网络中度值较高的TP53、AKT1、MAPK1、RELA作为分子对接中的蛋白受体。

图1 二至丸-非小细胞肺癌PPI网络

2.5 药物-成分-靶点网络图构建

将获得的主要活性化合物与疾病重要基因的交集导入Cytoscape3.7.1,绘制“药物-成分-靶点”网络图(图2),将药物成分按照Degree值大小进行排序,获取Degree值排名靠前的核心成分,获得网络图后将核心靶点及药物核心分子进行分子对接验证。

图2 二至丸-成分-靶点网络图

2.6 GO、KEGG分析结果

GO生物学富集分析结果显示共获得2529条结果,其中生物过程(BP)2319条,主要涉及受体配体活性、泛素样蛋白连接酶结合、苏氨酸磷酸酶/苏氨酸激酶活性等(图3);细胞组分(CC)58条结果,主要与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等相关;分子功能(MF)152条,主要涉及G蛋白-偶联胺受体活性等。KEGG富集分析结果(图 4) 共获得通路182条,主要涉及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等,提示二至丸可能通过上述通路起到对NSCLC的干预作用。

图3 GO分析生物过程、细胞组成,分子功能前10位的富集分析结果

图4 KEGG分析气泡图

2.7 分子对接结果

将槲皮素、木犀草素、山奈酚、金合欢素、β-谷甾醇依次与TP53、AKT1、MAPK1、RELA进行分子对接验证(最高分、最低分、平均分低于负五分可用),分数越低说明分子之间结合越紧密。结果表明,各成分与关键靶点的结合能均低于-5,均有较好的结合活性。其结果如表1、图5所示。

表1 二至丸主要活性成分和核心蛋白分子对接得分

图5 展示部分分子对接结合情况

本研究通过数据库检索发现,槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、金合欢素可能是二至丸治疗NSCLC的关键化合物。现代研究表明,槲皮素可激活PI3K/Akt通路,进而抑制癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,或是通过诱导VEGF受体2(VEGFR2)抑制肿瘤调控因子AKT的表达,进而影响肿瘤的生长[17-18]。有研究发现,木犀草素可能通过凋亡和自噬2条途径促进A549细胞死亡[19]。任开明[20]等人发现,木犀草素不仅促使A549细胞凋亡,还具有抑制A549细胞增殖、侵袭及迁移的能力。miR21是一种非编码小RNA,参与细胞多种生命活动,有研究表明,miR21可促进非小细胞肺癌A549细胞增殖,山奈酚可通过调节miR21/PTEN信号通路抑制A549细胞增殖[21-22]。周玲玉[23]等人研究表明,β-谷甾醇对A549 细胞具有明显的生长抑制作用,且药物浓度与细胞活性成反比。现代研究发现,金合欢素对A549细胞引起的NF-κB和激活蛋白1(AP-1)结合能力产生浓度依赖性的抑制,从而明显减少细胞的侵袭和迁移[24]。

经过网络药理学数据分析,得到以TP53、AKT1、MAPK1、RELA为核心的基因靶点,以上基因对肿瘤细胞都有重要调控作用。其中,TP53基因近年来研究较多,研究表明,超过半数的肿瘤具有TP53基因突变[25]。TP53为肿瘤抑制基因,负责调控细胞的增殖、凋亡过程,突变后的TP53基因空间构象发生改变,失去抑癌功能,导致细胞无限增殖,转变成恶性肿瘤[26]。AKT1可影响肿瘤细胞侵袭、迁移能力[27-28],其机制可能与调控多种细胞运动侵袭相关分子有关[29]。MAPK1在细胞生长、代谢、编程性死亡过程中起到重要调控作用,MAPK1可以通过激活ERK信号,增强细胞活动、迁移活动能力。研究者证实,抑制MAPK1表达可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移能力,延长细胞周期,促进细胞编程死亡[30]。李同林[31]等人研究发现,miR-7-5p作为微小RNA家族的一员,通过下调RelA抑制A549细胞侵袭。

本研究推测二至丸可能从AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路发挥作用。牟沧浪[32]等人研究发现,RAGE水平下降会对正常肺组织形态产生干扰,导致肺部肿瘤发生,与肿瘤细胞分化、凋亡有关。炎性因子增多是NSCLC的诸多致病因素中的一种,IL-17是在多种癌组织内显著表达的促炎细胞因子,在NSCLC癌组织中表达明显升高,且用IL-17刺激NSCLC细胞后能诱导其增殖[33-34]。有研究表明,IL-17与NSCLC患者肿瘤生长、浸润和转移呈正相关[35]。王郑林[36]等人研究发现,患者血清TNF-α水平与肺癌病情活动度呈正相关,其疼痛程度与血清TNF-α水平呈正相关。故猜测二至丸可能通过以下途径来作用于NSCLC:(1)作用于RAGE受体来影响肿瘤细胞分化、凋亡;(2)抑制IL-17炎性因子来抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移;(3)抑制TNF-α生成来减轻患者癌性疼痛,提高患者生存质量。

本研究通过网络药理学及分子对接技术初步发掘了二至丸中治疗NSCLC的相关活性成分和靶点,并发现二至丸可能是通过AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路发挥作用,为后续进一步研究提供新的思路与线索。

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