微生物肥料菌种筛选及优化

曹 熙，王恩彪，任晓珍，赵 欢

沈阳科技学院，辽宁 沈阳 110167

植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指在植物根系土壤中生存的有益菌，不仅可以促进植物生长，还具有防病害和提高作物收成的作用。目前发现的具有防病促生潜能的多个种类和属性的根系微生物包括芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、农杆菌属（A grobacterium）以及埃文氏菌属（Eriwinia）等[1-2]。

在农作物生产中应用微生物肥料可以明显起到增加产量和提高品质的效果。研究表明，施用微生物肥料可以明显促进水稻、玉米等粮食作物植株的生长和产量的增加，同时减少化肥的使用[3]。植物根际促生细菌能够通过多种途径促进植物的生长。因此，对PGPR 植物的生长促进机理和促进微生物肥料产业化的详细研究，已然成为当前对资源合理利用和环境保护具有重要意义的研究热点。

通过前期对菌株进行分离纯化、筛选及培养，得到了13 株具有高效解磷作用的菌株。本研究通过对试验菌株与解淀粉芽孢杆菌拮抗作用及与玉米大斑病病原菌拮抗作用进行评价，筛选出制备微生物肥料的目标菌种。

1.1 实验材料

LB 培养基、无菌培养皿、无菌镊子、无菌牛津杯、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、高压蒸汽灭菌锅、离心机、分光光度计。

1.1.1 试验菌株与解淀粉芽孢杆菌拮抗作用评价方法[4]

无菌培养皿底部倒一层已灭菌的LB 固体培养基，培养基凝固后，在距平皿中心2.5 cm 处放置经180 ℃干热灭菌1 h 的牛津杯，每皿放3 个，呈等边三角形。将灭好菌的LB 固体培养基倒入培养皿中，每皿约20 mL，紫外灯下开盖冷却后将牛津杯拔出，使固体平板上形成菌液池。

取100 μL 于30 ℃恒温振荡培养24 h 的解淀粉芽孢杆菌发酵液，加入制作好的平皿中央，涂布均匀。每个菌液池内加100 μL 于30 ℃恒温振荡培养24 h 的试验菌株发酵液，每皿的3 个菌液池互为对照，以接种等量无菌培养基为空白对照，于30 ℃恒温培养箱内培养24 h，待解淀粉芽孢杆菌长满整个平皿后，观察菌液池周围是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈直径。

1.1.2 试验菌株与玉米大斑病病原菌拮抗作用评价方法[5-6]

无菌培养皿底部倒一层已灭菌的LB 固体培养基，待LB 培养基凝固后，在距平皿中心2.5 cm 处放置经180 ℃干热灭菌1 h 的牛津杯，每皿放3 个，呈等边三角形。将灭好菌的PDA 培养基倒入培养皿，每皿约20 mL，紫外灯下开盖冷却后将牛津杯拔出，使固体平板上形成菌液池。

平皿中心接种玉米大斑病病原菌菌饼，在菌液池内加入100 μL 试验菌株发酵液，每皿的3 个菌液池互为对照，以接种等量无菌培养基为空白对照，于25 ℃恒温培养箱内培养至空白板上，菌丝生长至菌液池边缘。测量抑菌带宽度（细菌菌落边缘至病原菌菌丝边缘的距离）及玉米大斑病原菌菌落半径（玉米大斑病菌饼边缘至菌丝边缘的距离），并计算抑菌率：（空白对照玉米大斑病病原菌菌落半径-接种实验菌的平皿上玉米大斑病原菌菌落半径）×100%/空白对照玉米大斑病病原菌菌落半径。

2.1 试验菌株与解淀粉芽孢杆菌拮抗作用评价结果

试验菌株与解淀粉芽孢杆菌拮抗实验结果统计见表1。

表1 实验结果统计表

将解淀粉芽孢杆菌及试验菌株培养24 h 后，观察到其中8 个平皿上出现抑菌圈，说明13 株菌中有8 株菌与解淀粉芽孢杆菌存在不同程度的拮抗作用。其中，HF47.0 及HF48.1 两株菌于解淀粉芽孢杆菌拮抗作用最强，HF40.0 次之。HF34.0、HF36.0、HF43.1、HF43.2、HF48.2 五株菌与解淀粉芽孢杆菌不存在拮抗作用，可作为备选菌株加入微生物肥料。

2.2 试验菌株与玉米大斑病病原菌拮抗作用评价结果

试验菌株与玉米大斑病病原菌拮抗作用评价实验结果统计见表2。

表2 试验菌株与玉米大斑病病原菌拮抗实验结果统计表

除HF34.0 菌株外，13 株试验菌中其余12 株菌对玉米大斑病病原菌均有拮抗作用。其中，HF29.0及HF36.0 两株菌对玉米大斑病抑菌率达到70.0%，抑菌效果最好。其次，解淀粉芽孢杆菌及HF45.0、HF48.1、HF48.2、HF48.3、HFTY 等6 株菌的抑菌率达到60 %以上。

在分离纯化得到的13 株具有解磷作用的菌株中，5 株与解淀粉芽孢杆菌不存在拮抗作用，11 株对玉米大斑病病原菌的抑菌率达到50 %以上。其中，HF29.0 及HF36.0 两株菌对玉米大斑病病原菌的抑制作用最强，抑菌率达到70 %。

通过前期评价，初步选定HF36.0、HF43.1、HF48.2 三株菌作为目标菌剂添加至微生物肥料中。

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