布鲁氏菌病疫苗免疫评估与野毒感染区分试验

高武成，魏美清，王耀荣，彭 钰，周芙蓉，胡凤娜，杨海龙，丁忠杰

（华池县动物疫病预防控制中心，甘肃 华池 745600）

布鲁氏菌病简称布病，是由布鲁氏菌侵入机体引起的一种人畜共患传染病，常引起母畜流产、不育、关节炎等，人感染该病后，病程长，反复发作，难以治愈，严重威胁畜牧业和公共卫生事业健康发展[1]。

华池县在20世纪70年代初首次发现羊感染布病的病例，当时采用羊型5号布病疫苗对牛羊进行了大面积饮水免疫，80年代后集中进行布病检测，直到1992年达到甘肃省列布病“稳定控制区”考核达标县。随着华池县肉羊产业的持续发展壮大，加之畜禽调运频繁，导致羊布病病例逐渐增多，羊布鲁氏菌病的发病数由2012年的22只上升到2015年的616只，阳性率由0.2%上升到2.2%，华池县布病流行态势日趋严重，检出阳性率在逐年加大，除乔川、紫坊畔两乡外，其余各乡镇都有不同程度布病感染病例，布病发生最严重的乡镇有城壕镇、南梁镇、悦乐镇，新的布病流行形势引起了政府的高度重视。

为了遏制布鲁氏菌病流行，从2016年开始，对华池县1月龄以上的羊只（不包括种羊场和种公羊）采用S2疫苗灌服免疫，但S2疫苗免疫羊后，6个月内不能完全转阴，且与自然患病动物无法进行区分，给羊调运检疫工作带来一定的困扰。为了解决这一问题，华池县动物疫病预防控制中心在县内试点免疫布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株），通过开展免疫注射、抗体效果评估、抗体阳性与野毒感染区分等试验，探讨布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）在实际生产中的使用效果，以期为华池县布鲁氏菌病防控工作提供更多参考。

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 在华池县内选取2个养殖场，选取的试验羊群为3月龄以上羊只，未免疫过布鲁氏菌病疫苗，在免疫接种前对所有试验羊只加挂耳标进行标记。

1.1.2 试验疫苗 布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）购自金宇保灵生物药品有限公司，批号23950303，并搭配该公司专用稀释液进行稀释。

1.1.3 试验试剂 虎红平板凝集试验抗原，批号10012302。试管凝集试验抗原，批号10042302。阳性血清、阴性血清均购自青岛立见生物科技有限公司。

1.1.4 免疫物资 防护服、防护帽、乳胶手套、长臂手套、护目镜、N95口罩、雨鞋、金属注射器、注射用针头、新洁尔灭消毒液、75%酒精、棉球、碘酊、疫苗冷藏箱、消毒桶、垃圾回收袋等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组 免疫接种前，对试验动物健康状况进行询问调查和现场临床观察，并采集血液、分离血清，用虎红平板凝集试验进行布鲁氏菌病检测，剔除阳性畜。剔除阳性羊只后，组建阳性群、阴性群各300只（表1）。

表1 试验动物分组及免疫数量

1.2.2 疫苗稀释 用0.1%新洁尔灭对疫苗稀释液瓶和疫苗瓶进行喷雾消毒，再用75%酒精对疫苗瓶、稀释液瓶及瓶盖进行擦拭消毒，按照说明书要求比例用专用稀释液进行稀释。

1.2.3 环境压尘及畜群消毒 在免疫前首选对布鲁氏菌病敏感性高的消毒药，对免疫场地、圈舍地面及周围环境等进行压尘消毒，以喷湿地面、不泥泞、不起灰尘为最佳。消毒时将喷头高举空中，喷嘴向上以画圆圈方式按“先里后外，先上后下，先左后右”的顺序逐步喷洒，使药液呈雾状下落。以地面、圈舍及各角落湿润，羊体表稍湿为宜，由内及外，达到全面消毒压尘的目的。

1.2.4 免疫注射 对3月龄以上的羊只，用布鲁氏菌基因缺失活疫苗腿部皮下免疫注射1 mL。免疫结束后做好免疫记录，记录内容包括羊只数量、出生日龄、疫苗种类、生产批次、免疫时间和免疫剂量等。免疫后观察羊只有无过敏反应，如有及时采取补救措施。

1.2.5 免疫后抗体检测 免疫接种后30 d、90 d、120 d、150 d、180 d采集血清样品，按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2018）中的虎红平板凝集试验进行初步鉴定，并通过试管凝集试验进行复检。平板凝集被检血清出现颗粒状或絮状的凝集现象时，判定为阳性，试管凝集中被检血清以1∶50血清稀释，出现“++”以上凝集现象时，判定为阳性。统计抗体转阳率、转阴率等指标。转阳率=检测阳性样品数/样品总数×100%；
转阴率=检测阴性样品数/样品总数×100%。

1.3 试验结果

1.3.1 安全状况观察 免疫后12 h内未出现过敏反应，48 h内注射部位未见异常，羊只未出现不良反应，说明布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）腿部皮下注射比较安全。

1.3.2 免疫后抗体检测结果 由表2可知，阴性群免疫30 d后的虎红平板凝集试验抗体合格率为90.3%，试管凝集试验抗体合格率为88.5%，达到抗体合格率的高峰；
随后抗体水平开始下降，免疫90 d后，因饲养管理不当，羊群感染传染性胸膜肺炎，死亡3只，虎红平板凝集试验检测转阴率为79.3%，布病试管凝集试验抗体转阴率为88.5%；
免疫120 d后，虎红平板凝集试验检测样品转阴率为93.2%，试管凝集试验样品转阴率为94.6%；
免疫150 d后，虎红平板凝集试验样品转阴率为97.6%，试管凝集试验样品转阴率为98%；
免疫180 d后，虎红平板凝集试验样品转阴率为98%，试管凝集试验样品转阴率为98.7%。

表2 免疫接种后抗体水平检测结果

阳性群免疫30 d后，虎红平板凝集试验抗体合格率为88.6%，试管凝集试验抗体合格率为80.6%，达到抗体合格率的高峰；
免疫90 d后，虎红平板凝集试验检测样品转阴率为75%，试管凝集试验抗体转阴率为81.3%；
免疫120 d后，虎红平板凝集试验检测样品转阴率为86.2%，试管凝集试验样品转阴率为87.3%；
免疫150 d后，虎红平板凝集试验样品转阴率为90.5%，试管凝集试验样品转阴率为91.3%；
免疫180 d后，虎红平板凝集试验样品转阴率为93.6%，试管凝集试验样品转阴率为94%，残留6%的阳性畜。

在临床检测过程中，存在布病免疫抗体和感染抗体难以区分的现象，给布鲁氏菌病诊断检测净化工作带来困难，而布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）中敲除bp26基因，使用该疫苗免疫动物后可以区分自然感染抗体和免疫抗体[2]，能够为布病的检测净化提供一定参考。

2.1 材料与方法

2.1.1 试验动物及试剂 在免疫注射过程中，发现免疫180 d后，仍有动物血清检测为阳性，且阳性群高于阴性群，原因可能是阳性羊群养殖环境、水源等被污染，也可能是试验动物隐性带毒，因此对180 d未转阴的22只阳性羊采集血清进行检测。羊布鲁氏菌LPS和BP26蛋白ELISA抗体检测试剂盒购自内蒙古金迈诗生物科技有限公司。

2.1.2 结果判定 被检样品S/N值LPS＜3.1时，与S/N值BP26无关，则结果判定为阴性，表示没有免疫羊布鲁氏菌疫苗，同时也没有羊布鲁氏菌野毒株感染；
被检样品S/N值LPS≥3.6，且S/N值BP26＜3.3，则结果判为LPS阳性，表示布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）免疫抗体阳性。被检样品S/N值LPS≥3.6，且S/N值BP26≥3.8，则结果判为LPS和BP26蛋白抗体阳性，表示羊布鲁氏菌野毒株感染（S/N值LPS=SLPS/NCLPS；
S/N值BP26=SBP26/NCBP26，S/N值LPS表示样品在LSP包被板上S/N值，S/N值BP26表示样品在BP26包被板上S/N值，SLPS表示样品在LSP包被板上OD450nm值，SBP26表示样品在BP26包被板上OD450nm值，NCLPS表示LSP包被板上阴性对照OD450nm平均值，NCBP26表示BP26包被板上阴性对照OD450nm平均值）。

2.2 试验结果

采用ELISA方法分别对阴性场群、阳性场群的阳性羊只采集血清进行检测，结果（表3）显示：阴性群4份阳性样品均为免疫抗体阳性，阳性群18份样品16份为免疫抗体阳性，2份为布鲁氏菌野毒感染。

表3 免疫阳性和野毒感染区分试验结果

采用皮下注射的方法进行免疫接种不容易形成气溶胶，可有效降低环境污染和人员感染，更有利于布病防控。腿部皮下注射布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）后，阴性场群和阳性场群免疫30 d后抗体水平达峰值，阴性群抗体合格率达88.5%，阳性群转阴率达80.6%，随后抗体水平逐渐下降，免疫90 d后转阴率均在80%以上，阴性群转阴率大于阳性群，说明疫苗具有保护率高、转阴快的特点，对阴性群、阳性群都有较好的保护作用。

对超过180 d后不能转阴的羊只，采用羊布鲁氏菌LPS和BP26蛋白ELISA抗体检测试剂盒开展检测，可有效区分疫苗免疫阳性与野毒感染，避免因阳性畜漏检造成病原扩散蔓延以及阴性畜误杀造成养殖场（户）经济损失[3]，扭转了因注射其他疫苗导致羊只无法调运的被动局面。本次免疫阳性和野毒感染区分试验结果显示，阳性群体阳性数量增加2只，原因可能是阳性羊群养殖环境、水源等被污染，也可能是试验动物隐性带毒，还需要进一步跟踪评估。

羊布鲁氏菌LPS和BP26蛋白ELISA抗体检测试剂盒具有较好的敏感性，为布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）的应用提供配套疫苗免疫阳性与野毒感染区分方法，在布鲁氏菌病的快速诊断、检测和净化等方面发挥着积极作用，但该方法的前提是羊只未免疫过其他疫苗，在临床诊断过程中应予以注意。

本次布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）免疫效果评估试验和免疫阳性和野毒感染区分试验取得了较好效果，为华池县下一步开展集中免疫工作提供了科学依据。

布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）为减毒活疫苗，应当避免对怀孕母羊进行免疫，应于产羔后或配种前进行免疫。但在实际生产过程中，无法精准确定怀孕羊只，尤其是妊娠初期，无法进行识别，在进行疫苗推广时，建议与农户进行沟通，明确配种日期，避免造成不必要的经济损失。

布鲁氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）为减毒活疫苗，对牲畜和免疫接种操作人员仍有一定危害。因此，应对兽医技术人员和其他协助免疫的人员进行疫苗免疫技术、个人防护和防止疫病传播知识的培训。免疫时必须正确穿戴工作服、胶靴、手套、口罩、护目镜等，做好个人防护。

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