SYNPO2蛋白在狂犬病病毒复制过程中的功能初探

王姝捷,谢 鑫,张 曦,陈 明,雷桃红,邓俊杰,许运斌

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种高度致死性的人兽共患传染病,是当前危害人类公共卫生的重要疫病。所有种类的哺乳动物均对RABV易感,其中犬是RABV最主要的储存宿主和传播宿主,直接导致了世界范围内大多数人狂犬病的死亡。狂犬病在全世界范围内流行,造成每年约5～7万人死亡,其中约95%的人狂犬病死亡病例发生在非洲和亚洲[1]。我国在世界上属于狂犬病高发地区,发病和死亡人数曾在历史上一段时间仅次于印度,居全球第二[2]。狂犬病一旦发病,最终会出现几乎100%的死亡。因此,狂犬病极大的危害性使人们意识到加大对狂犬病病毒研究力度的必要性。目前,通过研究参与RABV复制过程中的宿主细胞因素,在细胞水平分析它们对RABV复制的作用,并揭示其调控RABV复制的分子机制,可为限制或阻断病毒在宿主体内的复制增殖提供靶标具有重要意义。

狂犬病病毒是不分节段、单分子负链RNA病毒,其基因组长度大约12 kb,编码5种病毒结构蛋白:核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L),顺序为3′-N-P-M-G-L-5′。在这5种病毒结构蛋白中,M蛋白的研究受到广泛关注。M蛋白由202个aa组成,约23 kD,是RABV病毒粒子中包膜内侧主要蛋白,也是病毒粒子中最小的病毒结构蛋白。M蛋白是一种多功能性蛋白,在调控病毒转录与复制、促进病毒粒子脱衣壳、促进病毒粒子组装和出芽、诱导特定细胞凋亡和影响病毒致病力等方面发挥着重要作用[3-10]。在诱导细胞凋亡方面,RABV病毒M蛋白可部分定位至线粒体,从而诱导细胞凋亡[7]。此外,有研究发现RABV野毒株GD-SH-01病毒M基因替代疫苗毒株HEP-Flury病毒M基因可显著促进重组病毒诱导的细胞自噬,但RABV的M蛋白本身并不能诱导细胞自噬[11]。那么,M蛋白是如何与自噬或凋亡相关的宿主细胞因素相关联进而参与或影响病毒复制,这是一个非常值得探讨的问题。

Podins是一个富含脯氨酸的肌动蛋白结合蛋白家族。SYNPO2是Podins家族的成员,该蛋白含有一个PDZ结构域和一个富含脯氨酸的基序(PPPY),被认为是侵袭性癌症的抑癌因子[12],其发生甲基化修饰是预测晚期肾癌抗血管生成反应的生物标志物[13]。有研究发现,在肌细胞中,SYNPO2与BAG3蛋白借助基序PPPY与WW结构域的相互作用,可促进肌细胞机械应激过程中自噬泡的形成[14]。还有研究发现,在神经元细胞中同样可以表达SYNPO2蛋白[15-16],但SYNPO2蛋白在正常神经元细胞尤其是病毒感染的神经元细胞中发挥着怎样的生物学功能和如何发挥功能尚不清楚,值得探讨。

本研究以RABV感染人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH为研究模型,借助分子生物学、细胞生物学、生物化学、病毒学等手段研究SYNPO2蛋白在RABV复制中的作用,为进一步深入研究SYNPO2影响RABV复制的具体分子细节奠定基础,有助于抗RABV新药物靶标的研究开发。

1.1 主要仪器与器材 实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司);冷冻离心机(美国Beckman公司);全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司);化学发光成像系统(美国BIO-RAD公司);二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司);蛋白电泳及转膜设备(美国BIO-RAD公司);激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司);普通荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);96 孔、6 孔细胞培养板(中国NEST公司);玻底培养皿(中国NEST公司);PCR八联管(中国上海生工公司)。

1.2 细胞和毒株 人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞,培养于含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。狂犬病病毒固定毒株CVS-11和候选疫苗毒株SRV9(均为二级生物安全操作水平毒株),在SK-N-SH细胞中扩繁,测定病毒滴度,分装,保存于-70 ℃。

1.3 抗体 狂犬病病毒M蛋白兔多抗,由本实验室委托杭州华安生物科技有限公司制备并保存;狂犬病病毒P蛋白鼠单抗由昆明理工大学生命科学与技术学院张金阳教授惠赠;beta-actin鼠单抗、GAPDH鼠单抗购自杭州华安生物技术有限公司;SYNPO2兔多抗(专用于WB)购自美国Proteintech公司;SYNPO2兔多抗(专用于IFA)购自北京博奥森生物技术有限公司;HA鼠单抗(用于WB和IFA)购自爱必信(上海)生物科技有限公司;HA兔单抗(专用于IFA)购自美国CST公司;FITC标记的羊抗兔IgG购自美国KPL公司;Alexa Flour 594 标记的羊抗鼠IgG购自美国CST公司;Alexa Flour 405标记的羊抗鼠购自英国abcam公司。

1.4 真核表达载体的构建及其转染 人源SYNPO2真核表达载体委托广州辉骏生物科技股份有限公司构建,以全基因合成的人源SYNPO2基因作为模板,采用特异性引物进行PCR,将全长人源SYNPO2基因克隆至PCI-neo-3xHA-MCS骨架载体中,并经测序验证成功。所采用的特异性引物为上游引物:CGTTCCAGATTACGCTCTCGAGATGGGCACAGGGGATTTTATC;下游引物:CCCTCACTAAAGGGAAGCGGCCGCTCATGTTTGG-CGTCTCCATC。SRV9毒株M基因真核表达载体由本实验室构建,以SRV9感染的细胞cDNA作为模板,采用特异性引物进行PCR,将全长M基因克隆至PCMV-N-myc骨架载体中,并经测序验证成功。所采用的特异性引物为上游引物:CGGAATTCCGATGAACCTCCTACGTAAGATAG-T;下游引物:CCGCTCGAGCGG TTATTCTAGAAGCAGAGAGGAAT。质粒转染SK-N-SH细胞采用ExFectTM转染试剂(中国Vazyme公司)。

1.5 人源SYNPO2 shRNA干扰质粒及其转染 SK-N-SH细胞中SYNPO2基因的敲降采用载体介导的shRNA干扰方法。pGPU6/Neo载体介导的shRNA用于干扰SYNPO2(NM_133477.3;产品编号:SYNPO2-homo-535,靶序为GCAGAAGA-GCTGATCTTAAGG;产品编号:SYNPO2-homo-1178,靶序列为GGGTGTTGATGTTTAAGAA-GC),这些载体和无义干扰 shRNA载体(靶序列为GTTCTCCGAACGTGTCACGT)购自上海吉玛生物技术有限公司。采用ExFectTM转染试剂将shRNA干扰载体转染至细胞密度达80%的SH-N-SH细胞。

1.6 免疫荧光实验 SK-N-SH细胞铺至玻底培养皿,即共聚焦平皿,过夜贴壁后转染PCI-neo-3XHA-SYNPO2质粒,转染一定时间后进行RABV感染;或共转染PCI-neo-3XHA-SYNPO2和PCMV-N-myc-M(SRV9)两个质粒。病毒感染或质粒共转染48 h后,弃去细胞上清,加入预冷的1xPBS洗涤3遍,然后吸干PBS,加入预冷固定液(甲醇∶丙酮=1∶1或4%多聚甲醛)对细胞进行固定,-20 ℃固定30 min或室温固定30 min。弃去固定液,用PBS漂洗若干遍。甲醇∶丙酮固定后的细胞加入含有一抗的5%脱脂奶;4%多聚甲醛固定后的细胞先采用0.1% Triton x-100对细胞进行通透,后加入含有一抗的5%脱脂奶,37 ℃孵育1.5 h。弃去一抗,用PBS漂洗3遍除去非特异性结合的抗体。然后加入含有相应荧光二抗的5%脱脂奶,37 ℃孵育1 h。弃去二抗,用PBS漂洗3遍。最后将共聚焦平皿置于蔡司共聚焦显微镜(德国蔡司公司)下观察荧光,并拍照,分析各蛋白亚细胞定位情况。

1.7 免疫印迹实验 RABV感染SK-N-SH细胞48 h后收取蛋白样品(裂解液裂解 (50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4, 1%SDS,1%Triton X-100, 1 mmol/L PMSF);或SYNPO2过表达质粒或shRNA干扰质粒瞬时转染SK-N-SH细胞,转染12 h后进行RABV感染,在RABV感染48 h后收取蛋白样品(裂解液裂解 (50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4, 1%SDS,1%Triton X-100, 1 mmol/L PMSF),冰上裂解5 min,然后与SDS 5ⅹ蛋白上样缓冲液(上海碧云天公司)100 ℃煮沸10 min。接着对煮沸过的蛋白样品进行4 ℃ 12 000 r/min 10 min的离心,取蛋白样品上清进行电泳,程序为80 V恒压120 min,至目的条带分离充分;300 mA 120 min条件进行湿转。湿转成功的NC膜用5%的脱脂奶37 ℃封闭1 h,弃去脱脂奶后用PBST洗膜三次;分别加入一抗稀释液稀释好的一抗,4 ℃孵育过夜;PBST洗涤3次,加入稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000)或羊抗兔(1∶1 000),室温孵育2 h;PBST洗膜3次,每次10 min,然后采用化学发光仪上进行ECL显色拍照,记录结果,导出图片后使用ImageJ软件进行定量分析。

1.8 病毒滴度测定实验 SYNPO2过表达质粒或shRNA干扰质粒转染细胞12 h后进行RABV感染,RABV感染48 h后收集感染细胞培养上清,接着对上清液进行病毒滴度测定。基本步骤如下:将细胞制成1×105个/mL细胞悬液,每孔100 μL接种于96孔中,37 ℃、5% CO2培养24 h至细胞长成单层。生物安全柜内用无血清DMEM/F12培养液进行10倍倍比稀释制备10-1～10-8共8个稀释度的病毒液接种于上述已准备好的细胞中,每个稀释度设6个复孔,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2孵箱中继续培养。病毒感染48 h后采用预冷固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)固定细胞,之后采用M兔多抗、FITC-羊抗兔IgG对细胞进行间接免疫荧光染色,接着采用普通荧光显微镜进行荧光信号的观察,并最终计算出病毒滴度(TCID50)。

1.9 实时荧光定量PCR实验 SYNPO2过表达质粒或shRNA干扰质粒转染细胞12 h后进行病毒感染,病毒感染48 h,采用TRIZOL裂解液进行细胞总RNA抽提。抽提出来的总RNA采用反转录试剂盒(Takara公司)反转成单链cDNA。狂犬病病毒基因组和反基因组RNA的反转录采用特异性引物进行,病毒mRNA和内参GAPDH mRNA的反转录采oligo(dT)20和随机引物进行。荧光实时定量qRT-PCR采用CFX96型荧光定量PCR系统(Bio-rad公司)和 1×SYBR premix EX-Taq(Takara)进行。PCR 的条件参数如下:50 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环。溶解曲线采用系统默认的PCR程序获得。定量数据的结果分析采用Bio-Rad CFX Manager 版本的软件进行。定量方法如下:分析病毒 mRNA、基因组、反基因组的差异表达水平采用相对定量的方法(2-ΔΔCt法)。

1.10 生物统计学分析 采用GraphPad Prism 5.0软件内置统计学软件t检验对各组数据统计学差异水平进行分析。检验水准α=0.05,P>0.05ns表示差异没有统计学意义、*表示P<0.05,**表示P<0.01和***表示P<0.001。

2.1 病毒感染状态下SYNPO2蛋白的表达变化 首先我们分析了RABV感染后SYNPO2蛋白的表达变化情况。如图1A、1B所示,免疫印迹分别分析了RABV毒株CVS-11和SRV9感染SK-N-SH细胞后SYNPO2蛋白的表达水平,结果显示,两种病毒感染48 h、72 h后,SYNPO2蛋白均呈现下调表达趋势(见图中SYNPO2/GAPDH灰度值比值)。

图1 免疫印迹分析病毒感染状态下SYNPO2蛋白的表达情况Fig.1 Western blot analysis of SYNPO2 expression during rabies virus infection

2.2 真核表达载体构建及表达鉴定 经广州辉骏生物科技股份有限公司对委托其构建的载体进行测序,结果显示载体中SYNPO2基因序列正确,且未发生移码;经生工生物工程(上海)股份有限公司对本实验室构建的载体进行测序,结果显示SRV9毒株M基因序列正确,且未发生移码。接着将PCI-neo-3xHA-SYNPO2、PCMV-N-myc-M(SRV9)及其各自的对照骨架质粒转染SK-N-SH细胞,转染48h收获细胞总蛋白样品,分别采用HA鼠抗和myc鼠抗免疫印迹检测各融合蛋白 ,条带大小与预期大小相符(图2A、2B)。如此成功构建了PCI-neo-3xHA-SYNPO2和PCMV-N-myc-M(SRV9)真核表达载体。

图2 免疫印迹分析真核表达载体的表达情况Fig.2 The expression of eukaryotic expression vector analyzed by western blotting

2.3 干扰载体构建及干扰效果鉴定 经上海吉玛生物技术有限公司对委托其构建的SYNPO2 shRNA干扰载体进行测序,结果显示载体中相关序列完全正确,且未发生移码。接着将各个编号的SYNPO2 shRNA质粒转染至细胞一定时间,收获蛋白样品进行免疫印迹分析。如图3A、3B,结果显示,编号535 shRNA质粒对SYNPO2干扰效果最佳。因此,最终选择干扰效果最佳的编号535 shRNA质粒和干扰效果偏中等的编号1178 shRNA质粒进行下游干扰实验。

图3 免疫印迹筛选SYNPO2 shRNA有效干扰质粒Fig.3 Screening of the interference plasmid of SYNPO2 shRNA by western blotting

2.4 过表达SYNPO2对RABV复制影响的分析

2.4.1 过表达SYNPO2对RABV病毒蛋白表达影响的分析 在2.2的基础上,我们进一步分析了SYNPO2过表达后对RABV病毒SRV9蛋白表达的影响。如图4A、4B,结果显示,在病毒感染48 h后(48 h p.i.),过表达SYNPO2后相对于对照组可引起病毒M蛋白的显著累积(P<0.05*,其中图4B为图4A的WB灰度值比值所作柱状图)。

注:A. 免疫印迹分析过表达SYNPO2对RABV病毒蛋白表达的影响。B.ImageJ 软件分析A中M、beta-actin蛋白条带灰度值,并计算M/beta-actin灰度值比值及作统计学分析。C.相对定量qRT-PCR分析过表达SYNPO2对RABV病毒转录和复制水平的影响。D.TCID50测定分析过表达SYNPO2对RABV病毒感染力的影响。

2.4.2 过表达SYNPO2对RABV病毒转录和复制水平影响的分析 由此同时,我们分析了SYNPO2过表达后对RABV病毒SRV9基因组转录和复制水平的影响。如图4C,结果显示,在48 h p.i.,过表达SYNPO2相对于对照组未引起病毒M基因转录水平的显著变化(P>0.05ns),且未引起病毒基因组复制水平的显著变化(P>0.05ns)。

2.4.3 过表达SYNPO2对RABV病毒感染力影响的分析 此外,我们分析了SYNPO2过表达后对细胞释放可感染性RABV病毒粒子能力的影响。如图4D,结果显示,在48 h p.i.,过表达SYNPO2相对于对照组未显著增强细胞释放可感性RABV病毒粒子的能力(P>0.05ns)。

2.5 干扰SYNPO2对RABV复制影响的分析

2.5.1 干扰SYNPO2对RABV病毒蛋白表达影响的分析 在2.3的基础上,我们进一步分析了SYNPO2敲降后对RABV病毒SRV9蛋白表达的影响。如图5A、5B,结果显示,在48 h p.i.,相对于无义shRNA质粒(shNC)对照组,采用shRNA(编号535 shRNA质粒和编号1178 shRNA质粒)敲降SYNPO2后能够导致病毒M蛋白水平的显著下降(编号535 shRNA质粒相对于shNC组P<0.01**;编号1178 shRNA质粒相对于shNC组P<0.001***)。

注:A. 免疫印迹分析干扰SYNPO2对RABV病毒蛋白表达的影响。B.ImageJ 软件分析A中M、beta-actin蛋白条带灰度值,并计算M/beta-actin灰度值比值及作统计学分析。C.相对定量qRT-PCR分析干扰SYNPO2对RABV病毒转录和复制水平的影响。D.TCID50测定分析干扰SYNPO2对RABV病毒感染力的影响。

2.5.2 干扰SYNPO2对RABV病毒转录和复制水平影响的分析 我们分析了SYNPO2敲降后对RABV病毒SRV9基因组转录和复制水平的影响。如图5C,结果显示,在48 h p.i.,相对于shNC对照组,采用shRNA敲降SYNPO2后未引起病毒M基因转录水平的显著变化(P>0.05ns),且未引起病毒基因组复制水平的显著变化(P>0.05ns)。

2.5.3 干扰SYNPO2对RABV病毒感染力影响的分析 我们分析了SYNPO2敲降后对细胞释放可感染性RABV病毒粒子能力的影响。如图5D,结果显示,在48 h p.i.,相对于shNC对照组,采用shRNA敲降SYNPO2后可显著降低细胞释放可感性RABV病毒粒子的产量(P<0.05*)。

2.6 病毒感染和真核表达状态下SYNPO2蛋白定位情况 为了确定病毒感染情况下细胞内SYNPO2蛋白与病毒M蛋白的相对位置关系,我们将3xHA-SYNPO2质粒分别转染SK-N-SH细胞,转染12 h后进行RABV病毒SRV9感染,病毒感染36 h后固定细胞,进行间接免疫荧光实验。即分别采用HA标签鼠单抗和M蛋白兔多抗、SYNPO2兔多抗和P蛋白鼠单抗对RABV感染的SK-N-SH细胞进行双蛋白标记,然后采用相应的荧光二抗Alexa Fluor 594-羊抗鼠IgG和FITC-羊抗兔IgG进行显示,并采用激光共聚焦显微镜拍照。如图6A-6B,结果显示,RABV感染细胞中SYNPO2与M蛋白存在明显共定位关系,而SYNPO2与P蛋白则未有此现象。此外,我们将3xHA-SYNPO2与PCMV-N-myc-M(SRV9)质粒共转染SK-N-SH细胞,转染48h后固定细胞,进行间接免疫荧光实验,结果显示真核表达情况下SYNPO2与M蛋白也存在共定位关系(如图6C)。

注:A.病毒感染情况下M蛋白与SYNPO2的亚细胞定位情况;B.病毒感染情况下P蛋白与SYNPO2的亚细胞定位情况;C.真核表达状态下M蛋白与SYNPO2的亚细胞定位情况

RABV病毒M蛋白对病毒基因组转录和复制之间平衡的调节,以及该蛋白在病毒粒子的聚集和出芽方面发挥的重要作用,都已被广泛描述[3,17]。另外,研究发现RABV病毒M蛋白通过定位于线粒体从而诱导细胞凋亡[7],同时该病毒蛋白与RABV诱导的细胞自噬密切相关[11]。RABV病毒M蛋白如何与自噬或凋亡相关的宿主细胞因素相关联进而参与或影响病毒复制尚不清楚。研究发现,SYNPO2在肌细胞中与自噬相关[14],在神经元细胞中同样可以表达[15-16],但SYNPO2蛋白在正常神经元细胞尤其是病毒感染的神经元细胞中发挥着怎样的生物学功能和如何发挥功能也不清楚。在本研究中,我们通过免疫印迹分析发现,RABV感染细胞可引起SYNPO2蛋白的下调表达,这提示着SYNPO2蛋白可能在RABV复制过程中发挥着作用。此外,我们发现在病毒感染或真核表达细胞中病毒M蛋白与SYNPO2蛋白有显著共定位关系。由此,我们推测RABV感染引起的SYNPO2蛋白表达的下调表达可能与病毒M蛋白有直接相关性,这将在后续的研究中进行深入探讨。

目前,大量研究表明M蛋白多功能性的发挥除了受到其自身基因组分的调控,同时也受到宿主蛋白的调控。其中M蛋白可利用宿主细胞不同种类的蛋白质来实现其功能。M与NF-κB家族蛋白RelAp43结合,降低RelAp43与ABIN2互作,同时抑制RelAp43与p105-ABIN2-TPL2复合体的结合,导致RelAp43-p50 NF-κB二聚体的形成,从而抑制NF-κB信号途径及IFN-β的诱导表达,最终影响RABV的致病力[10]。宿主细胞蛋白ATP6V1A通过与M蛋白互作促进病毒粒子脱衣壳,进而促进RABV复制[4]。最近有研究发现,M和细胞蛋白TSG101的相互作用不仅对来自感染细胞的子代病毒粒子的有效出芽至关重要,而且对子弹形病毒粒子形态的形成也至关重要[6]。尽管如此,相较于病毒M蛋白本身在RABV复制中发挥着诸多重要的生物学功能,病毒M蛋白如何与细胞蛋白相关联进而影响RABV复制的研究还是相对较少。在本研究中,我们发现过表达SYNPO2可显著促进病毒M蛋白表达,干扰SYNPO2则显著抑制病毒M蛋白的表达,但两者均未显著影响病毒M基因的转录及病毒基因组的复制水平;同时,过表达SYNPO2总体上未显著影响感染性病毒粒子的释放,而干扰SYNPO2可显著抑制感染性病毒粒子的释放。由此显示,SYNPO2在RABV复制过程中起着正向调控作用。进一步的研究,我们发现病毒M蛋白与SYNPO2存在显著共定位关系,遗憾的是我们通过免疫共沉淀实验并未检测到SYNPO2与M蛋白的相互作用。那么,SYNPO2蛋白如何影响病毒M蛋白表达和病毒复制?这有待后续深入的研究。

此外,有研究发现RABV感染动物中枢神经系统后,病毒抗原主要存在于动物大脑皮质、海马、皮质下结构的神经元中,而在脑干和小脑中不存在;在对动物进行外周接种病毒后,病毒抗原在躯干和小脑结构中积累最多,在皮质下和其他脑组织中检测到的抗原较少[18]。同时在别的研究中也发现,病毒感染大鼠后,病毒抗原主要存在于脑干、小脑、皮质、海马和纹状体中[19]。由此提示,RABV感染动物后,对动物大脑中枢神经系统不同部位的感染力不一样,而这可能与不同部位细胞内部的蛋白表达水平不一有关。有研究发现,在神经元细胞中可表达SYNPO2蛋白[15-16],但是大脑不同部位细胞SYNPO2蛋白含量有差异(参考人蛋白质数据库:https://www.proteinatlas.org/ENSG00000172403-SYNPO2/brain)。那么,RABV在感染动物或人大脑中枢神经系统后,病毒对不同部位的感染性是否与不同部位的SYNPO2蛋白含量相关?这将在后续的研究中展开验证。

总而言之,本研究我们初步发现了SYNPO2蛋白对RABV复制起着正向调控作用,这可能与病毒M蛋白直接相关。这些发现为进一步解析SYNPO2影响RABV复制的分子机理奠定基础,甚至可能通过进一步的研究,寻找到抗狂犬病药物研究的新方向。

利益冲突：无

引用本文格式：王姝捷,谢鑫,张曦,等.SYNPO2蛋白在狂犬病病毒复制过程中的功能初探[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):154-160. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.025

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