全自动加速溶剂萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定土壤中7种杀线虫剂的残留量

孔凡华,曹俊萍,葛伟伟

(1.山东省临沂生态环境监测中心, 临沂 276001;2.临沂市生态环境综合执法支队, 临沂 276001;3.临沂市生态环境监控中心, 临沂 276001)

线虫病是由线形动物门线虫纲多种线虫引起的一类蠕虫病[1-2]。我国较为严重的植物线虫病有根结线虫病、甘薯茎线虫病、松材线虫病等。其中:根结线虫病侵入后会造成作物地上部分生长减弱、变黄;甘薯茎线虫病主要危害甘薯块根、茎蔓及秧苗;松材线虫病对松树等针叶类植物具有毁灭性危害,具有传播迅速、致病性强、防治难度大等特点[3-5]。常用于防治线虫病的农药有棉隆、噻唑膦、灭线磷、丰索磷、杀线威、丁硫环磷、除线磷等[6-8],如采用低剂量棉隆熏蒸、10%(质量分数)噻唑膦溶液喷洒等可以有效防治根结线虫病等。在施用这些杀线虫剂时,绝大部分农药会残留在土壤中,不仅造成土壤生态环境的破坏,而且会进一步被作物吸收。当人们误食被污染的作物时,轻者引起头晕等症状,严重时会导致身体麻痹、呕吐等,甚至死亡[9-10]。因此,加强对土壤中杀线虫剂的监测,对于指导农药投入品的合理使用,保护人们赖以生存的环境具有重要意义。

现阶段暂无关于土壤中杀线虫剂的国家标准,地方标准为DB37/T 643-2006 《土壤中灭线磷残留量测定 气相色谱法》。相关文献报道较少,如文献[11]报道了灭线磷在稻田土壤和田水中的降解动态和残留分析,文献[12]报道了噻唑膦在甘蔗和土壤中的残留消解动态及风险评估,但是这些文献方法研究的杀线虫剂种类单一,不能全面地反映土壤中杀线虫剂残留的水平和种类。为较为全面的监测当地杀线虫剂的使用情况,有效保护土壤资源和环境,本工作以棉隆、噻唑膦、灭线磷、丰索磷、杀线威、丁硫环磷、除线磷为研究对象,提出了全自动加速溶剂萃取联合固相萃取法提取、净化,超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定土壤中7种杀线虫剂含量的方法。

1.1 仪器与试剂

Waters XEVO TQ-XS型超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪;Thermo ASE300型全自动加速溶剂萃取仪;Fotector-02HT高通量型全自动固相萃取仪;AB104-S型电子天平(精度0.1 mg);SIGMA 3K15型高速冷冻离心机;Milli-Q Direct-Q10型超纯水器。

单标准储备溶液:10 mg·L-1,取棉隆、噻唑膦、灭线磷、丰索磷、杀线威、丁硫环磷、除线磷标准溶液各1.0 mL置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释,摇匀。

混合标准溶液系列:取单标准储备溶液,用乙腈稀释,配制成各杀线虫剂质量浓度为0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 2.0 mg·L-1的混合标准溶液系列。

棉隆标准溶液编号为SPL-BD-090,噻唑膦标准溶液编号为A13944500AL-100,灭线磷标准溶液编号为A13300000ME-100,丰索磷标准溶液编号为SH-22853XM,杀线威标准溶液编号为SH-24635XA,丁硫环磷标准溶液编号为GBW(E)081355,除线磷标准溶液编号为SH-26025XC,各标准溶液的质量浓度均为100 mg·L-1。甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈均为色谱级;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Shimadzu Venusil MP C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm, 3.0 μm);柱温40 ℃;流量0.3 mL·min-1;进样量10 μL;流动相A为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为甲醇。梯度洗脱程序:0～3.0 min,A由81%降至45%,保持1.0 min;4.0～8.0 min,A由45%降至11%,保持3.0 min;11.0～11.1 min,A由11%跳转至81%,保持1.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI+)扫描模式;喷雾电压550 V;离子源温度450 ℃;辅助气压力0.414 MPa;离子传输管温度450 ℃;气帘气压力0.138 MPa;碰撞气为氮气;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数

1.3 试验方法

随机采集土壤样品,风干后挑去土壤中的杂物,置于钢制粉碎机中粉碎,反复粉碎使样品全部通过120目(孔径0.125 mm )筛,置于广口瓶中,于2～8 ℃储存。分取10.0 g,置于加速溶剂萃取池中,加入硅藻土15.0 g,按照以下条件萃取:萃取溶剂为体积比2…1的甲醇和三氯甲烷混合溶液,加热温度为90 ℃,加热时间为10 min,萃取压力为10 MPa,萃取时间为20 min,冲洗体积为70%池体积,循环次数为3次。萃取完毕后,取萃取液待净化。取HLB固相萃取柱,依次用 8 mL水、8 mL甲醇、8 mL三氯甲烷活化。将上述萃取液以15 mL·min-1流量过活化好的HLB固相萃取柱,用10 mL体积比1∶1的甲醇和乙腈混合溶液洗脱。收集洗脱液,置于水浴氮吹仪中,于45 ℃氮吹至近干,加入乙酸乙酯1 mL,溶解后过0.22 μm滤膜,所得样品溶液用UHPLC-MS/MS测定。

2.1 萃取方法的选择

用于萃取土壤样品中农药的方法主要有超声辅助萃取法、索氏提取法、全自动加速溶剂萃取法等。其中,超声辅助萃取法较为简单,但提取率偏低;索氏提取法提取率较高,但加热过程易造成丁硫环磷损失,导致其回收率偏低,同时该方法操作较为繁琐,耗费有机试剂较多,环境友好度偏低;全自动加速溶剂萃取法不仅提取率高,而且整个萃取过程均在密闭环境中进行,对环境污染小。以加标土壤样品(加标量0.05 mg·L-1)为待测对象,试验比较了上述3种方法对7种杀线虫剂的萃取效果,萃取时间分别为35, 45, 20 min,回收率结果见表2。

表2 萃取方法的比较

由表2可知,全自动加速溶剂萃取法所得7种杀线虫剂的回收率最高,且其耗时也最短,因此试验选择的萃取方法为全自动加速溶剂萃取法。

2.2 净化方法的选择

净化土壤萃取液的方法主要有固相萃取法、凝胶净化色谱法和QuEChERS等。凝胶净化色谱法净化效果较好,但试剂用量大,且仪器较为昂贵,方法适用性较差;QuEChERS操作简单,但净化效果较差,准确度和灵敏度差;固相萃取法操作较为简单,净化效果好,且试剂用量较少,环境友好度高。以加标土壤样品(加标量0.05 mg·L-1)为待测对象,试验比较了上述3种方法对7种杀线虫剂的净化效果,回收率结果见表3。

表3 净化方法的比较

由表3可知,固相萃取法所得7种杀线虫剂的回收率最高,因此试验选择的净化方法为固相萃取法。

2.3 质谱条件的优化

取1.0 mL 棉隆单标准储备溶液,用乙腈稀释,配制成100 μg·L-1棉隆标准溶液,设定仪器模式为MS only,注入上述溶液,进行一级全扫描,得到棉隆母离子;对母离子进行产物离子扫描,选择响应值最大的子离子作为定量离子,次大的子离子作为定性离子。根据选定的2个子离子,分别优化碰撞电压和去簇电压,即建立棉隆的MRM质谱方法。同法建立噻唑膦、灭线磷、丰索磷、杀线威、丁硫环磷、除线磷的MRM质谱方法。详细参数见表1。

在上述优化的仪器工作条件下,混合标准溶液的典型色谱图见图1。

1-棉隆; 2-噻唑膦;3-灭线磷;4-丰索磷;5-杀线威;6-丁硫环磷;7-除线磷

2.4 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各杀线虫剂的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,各杀线虫剂标准曲线的线性范围均为0.005～2.0 mg·L-1,其他线性参数见表4。

表4 线性参数和检出限

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表4。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对土壤样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n=6)

由表5可知,7种杀线虫剂的回收率为87.2%～101%,测定值的RSD为1.5%～3.8%,说明此方法的准确度和精密度良好。

2.6 样品分析

经查阅,关于液相色谱-串联质谱法检测涵盖本法所测的7种杀线虫剂的国家标准为GB/T 20769-2008 《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》,按照本法前处理随机采集的土壤样品,平行制备两份样品溶液,分别采用国家标准方法和本法测定,所得结果见表6。

表6 样品分析结果

由表6可知:在随机采集的5个土壤样品中,有4个样品均有不同程度的杀线虫剂检出;相比较国家标准方法,本法检出的杀线虫剂的种类更多,检出量更高。

本工作采用全自动加速溶剂萃取法提取土壤样品中棉隆、噻唑膦、灭线磷、丰索磷、杀线威、丁硫环磷、除线磷等7种杀线虫剂,HLB固相萃取柱净化萃取液,UHPLC-MS/MS进行定性、定量检测。方法具有自动化程度高、检测结果准确等特点,适用于土壤样品中微量残留杀线虫剂的监测。

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