氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺杀灭或抑制病原体的活性研究

苏思雨，陈楠楠，赵志博，朱战波，2，周玉龙，2，张泽财，2，刘宇，2

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；
2.黑龙江省牛病防控工程技术研究中心）

近年来，我国的畜禽集约化养殖模式发展迅速，致病微生物对于畜禽业健康发展的影响越来越大。由细菌和病毒引起的畜禽疫病不仅能严重影响畜禽健康及其相关产品的品质和产量，造成畜牧业严重的经济损失[1-2]，还威胁着人类健康。因此，畜禽养殖场的疫病防控工作是至关重要的，其中消毒剂的广泛使用发挥了重要作用。当前畜禽业常用的消毒剂主要包括卤素类、酸类、碱类、醇类、酚类、醛类、强氧化剂类以及季铵盐类等[3]。其中，强氧化剂类消毒剂能快速杀菌，但其化学性质不稳定，容易分解，甚至释放有毒有害气体。在日常生活中广泛使用的含氯消毒剂对金属具有腐蚀性，对人皮肤和黏膜有刺激性，释放有毒气体。另外，醇、酚和醛类消毒剂也存在易挥发，释放有毒有害气体以及遇明火易燃等安全问题。因此，低毒安全，对人和物品无腐蚀性的季铵盐类消毒剂引起了人们的关注。

季铵盐类化合物（Quatemary ammonium compounds，QACs）属于阳离子表面活性剂，无色无味，无腐蚀性，刺激性低，可对畜禽的体表和饮水消毒，具有长效、高效、广谱杀菌等特点，得到了广泛的应用[4-5]。畜禽生产中QACs 常用于环境消毒、器具消毒、体表消毒、术前手部消毒、创面消毒以及农作物饲料的防霉[6]，在预防动物疾病中发挥着重要作用[7]。此外，QACs 易吸附于物体表面，化学性质稳定，且与防冻剂有较好的相容性，所以在长效抑菌和低温消毒方面也有广阔的应用前景。QACs 按化学结构可以分为单链季铵盐和双链季铵盐，两种季铵盐的消毒杀菌机制基本相同，表现为QACs 溶解时解离出的季铵盐阳离子吸附到表面有负离子的病原体上，破坏膜结构，增强膜的通透性，使蛋白质和其他营养物质泄露，影响细胞的呼吸和糖代谢过程，引起蛋白质变性，呈现杀菌作用[8]。而双链季铵盐与单链季铵盐的不同，主要表现在双链季铵盐能够干扰病原体合成核酸和蛋白质的过程[9]。多项研究发现，QACs 能够杀灭多种细菌和亲脂病毒，如苯扎氯铵能够有效杀灭大肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及克雷伯菌等革兰阴性菌，对链球菌、葡萄球菌、真菌、厌氧菌和霉菌也有杀灭作用[4]。此外，0.2%的苯扎氯铵溶液可在15 s内杀灭新型冠状病毒（SARS-CoV-2）[10]，10 mg·L-1羟乙基/羟丙基季铵盐对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率达到了100%，且毒性低[11-12]，烷基二甲基苄基氯化铵和双癸基二甲基氯化铵消毒剂可在-18 ℃下杀灭脊髓灰质炎病毒[13]。QACs 对真菌也有杀灭作用，研究发现以苯扎溴铵和六亚甲基四胺为主要成分的复合消毒剂，不仅可以杀灭大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，还能有效地杀灭黑曲霉孢子和白色念珠菌[14]。

试验旨在明确自主合成的季铵盐表面活性剂氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide，C12cmpC）对黑龙江部分地区禽源病原菌和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）的杀灭或抑制活性，为基于季铵盐表面活性剂消毒剂的开发和应用提供依据。

1.1 菌株、病毒株和细胞

鹅源大肠杆菌（DQ207234、QE1-2-1、XH197291、QE1-3-1、YZE191205、QE191291、QS195313[15]）、鸡巴氏杆菌（DQ203719）、鸡链球菌（DQ205134）、鸡金黄色葡萄球菌（DQ204741）分离株由实验室分离鉴定。ATCC 标准菌株：大肠杆菌（ATCC10536）和金黄色葡萄球菌（ATCC6538）。CP 型BVDV（NADL 株），牛肾细胞（Madin-darby bovine kidney，MDBK）保存于黑龙江省牛病防控工程技术研究中心。

1.2 主要试剂

氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide，C12cmpC）由齐齐哈尔大学郭祥峰教授团队合成（见表1）。甘氨酸购自郑州市千盛化工原料有限公司；
卵磷脂购自郑州福宏生物科技有限公司；
吐温-80 购自江苏省海安石油化工厂。营养琼脂（NB）和营养肉汤（NA）购自青岛海博生物技术有限公司；
胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司；
Penicillin-Streptomycin Solution 购自Invitrogen 公司；
反转录试剂盒购自TaKaRa 公司；
TB Green Premix Ex Taq II 购自TaKaRa 公司；
TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司；
CCK-8 细胞增殖检测试剂盒购自Dojindo Laboratories 公司。

1.3 方法

1.3.1 抗细菌活性测定

1.3.1.1 最低抑菌浓度（MIC）测定

依据VAH 方法7 和EN 14885[16-17]，通过微量稀释法测定C12cmpC 对不同致病菌的最低抑菌浓度。用灭菌蒸馏水将C12cmpC 原液（浓度为2 000 mg·L-1）进行二倍稀释，得到8 个不同浓度的C12cmpC。用PBS 将指示菌浓度稀释至5×105～5×106CFU·mL-1。使用96 孔细胞培养板进行检测。试验组：每孔添加80 μL 营养肉汤培养基、10 μL C12cmpC 和10 μL 细菌悬液；
空白对照组：每孔添加100 μL 营养肉汤培养基；
阳性对照组：每孔添加90 μL 营养肉汤培养基和10 μL 细菌悬液。随后将细胞板置于37 ℃培养24 h，观察细菌的生长状况，确定最低抑菌浓度，试验做了3 次重复。

1.3.1.2 最低杀菌浓度（MBC）测定

参照德国卫生标准，微生物学（DGHH）方法和EN 14885[16-18]以及最低抑菌浓度试验方法，将不同浓度的C12cmpC 与相应试验菌的悬液混合，吸取100 μL混合液加入到营养琼脂固体培养基中，用玻璃涂布棒涂抹均匀，37 °C 恒温培养24 h。随后进行菌落计数，确定C12cmpC 的MBC，试验重复3 次，悬浮液细菌检出量为1.0～5.0×108CFU·mL-1。

杀菌率=（对照组菌数-样品组菌数）/对照组菌数×100%

1.3.1.3 时间杀菌试验

参照VAH 方法8 和EN 14885[16-17]，将不同稀释度的C12cmpC 和试验菌混匀，置于20 ℃水浴中。将0.1 mL 细菌悬液和10 mL C12cmpC 混合，分别作用1、5、15、30 min。然后，立即吸取0.1 mL 混液与10 mL中和剂在试管中混匀，持续作用10 min，再取0.1 mL混合液与10 mL 营养肉汤培养基在试管中混匀，置于37 °C 下培养24 h，观察细菌生长状况，试验做3次重复。

1.3.2 抗病毒活性测定

1.3.2.1 C12cmpC 对细胞生长状况的影响

待接种于24 孔板的MDBK 细胞贴壁生长密度达到80%时，加入各试验浓度的C12cmpC 溶液，混合均匀。终浓度分别为1、2.5、5、10、20 mg·L-1。另设置一个不加C12cmpC 的对照组。随后将细胞板在5% CO2、37 ℃培养箱中恒温培养12、24、48、72 h，分别在显微镜下观察各时间点的细胞生长状况。

1.3.2.2 C12cmpC 对细胞活性的影响

根据CCK-8 试剂盒说明书的操作步骤，设置5个试验组，每组分别含有1、2.5、5、10、20 mg·L-1C12cmpC 溶液的MDBK 细胞。设置2 个对照组，分别为无细胞组和不添加C12cmpC 溶液组。每个组设有5 个重复孔，将96 孔板置于5% CO2，37 ℃培养箱中恒温培养72 h。然后，弃掉培养基，用PBS 轻缓地洗涤细胞2 次，添加100 μL DMEM 培养基和10 μL CCK-8 试剂，轻敲细胞板混匀，置于37 ℃恒温培养箱5%、CO2条件下避光孵育2 h，最后用酶标仪检测各组溶液的OD450值，计算各试验组的细胞存活率。

1.3.2.3 C12cmpC 抗BVDV 病毒效果

参照EN 14885[16]方法，选取浓度为5 mg·L-1的C12cmpC 与BVDV 分别作用1、5、30、60 min。随后，从各试验孔吸取50 μL 混合液加入到MDBK 细胞中。设置3 个对照组，分别为MDBK 细胞组，MDBK细胞+C12cmpC 组以及BVDV+MDBK 细胞组。将细胞板置于37 ℃恒温培养箱、5% CO2条件下培养72 h，收集细胞，Trizol 法提取RNA，再用反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，采用SYBR Green 法和CFX96 Touch Real-Time PCR 系统检测分析MDBK细胞中BVDV mRNA 的表达水平，反应体系参照TaKaRa 的实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明书。BVDV 的引物序列为5′-GAG TAC AGG GTA GTC GTC AG-3′和5′-CTC TGC AGC ACC CTA TCA GG-3′[19]。β-actin 引物序列为5′-CGC ACC ACT GGC ATT GTC AT-3′和5′-TCC AAG GCG ACG TAG CAG AG-3′[19]。实时荧光定量PCR 的详细反应条件为95 ℃30 s，95 ℃10 s，56 ℃30 s，72 ℃15 s，40 个循环。每个样品3 次重复，差异基因的表达分析参照2-ΔΔCt方法。

1.3.3 统计分析

采用GraphPad Prism 6.0 中的One-way ANOVA、Two-way ANOVA 以及Student’s unpaired t-test分析方法进行数据统计分析。P＜0.05 时，组间差异具有统计学意义，* 代表P＜0.05，** 代表P＜0.01，***代表P＜0.001，所有数值表示均为平均值±相对标准偏差的形式统计分析数据。

2.1 C12cmpC 的MIC 试验结果

C12cmpC 的MIC 检测结果表明，C12cmpC 对鹅大肠杆菌（DQ207234）、鹅大肠杆菌（YZE191205）和鸡链球菌（DQ205134）的MIC 均为500 mg·L-1，对其余7 株分离株的MIC 均为250 mg·L-1。对大肠杆菌标准株（ATCC 10536）和金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 6538）的MIC 均为31.25 mg·L-1，低于10 株 分离株（见表2）。

2.2 C12cmpC 的MBC 及时间杀菌试验结果

C12cmpC 的MBC 及时间杀菌检测结果表明，C12cmpC 对鹅大肠杆菌（QS195313）的杀菌效果最好，500 mg·L-1的C12cmpC 作用1 min 可达到99.9%的杀菌率。500 mg·L-1的C12cmpC 作用5 min 时，对鹅大肠杆菌（QE191291）、鸡巴氏杆菌（DQ203719）和鸡金黄色葡萄球菌（DQ204741）的杀菌率为99.9%（见表3）。

表3 氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺的最低杀菌浓度试验结果Table 3 Test results of the minimum bactericidal concentration of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide

2.3 C12cmpC 对MDBK 细胞生长状态的影响

选择不同浓度的C12cmpC 处理MDBK 细胞，分别在作用12、24、48、72 h 时，显微镜下观察各试验组MDBK 细胞的生长状态。结果显示（图1），在相同作用时间点，C12cmpC 的浓度越高，MDBK 细胞的生长状态越差。此外，同一浓度C12cmpC 作用MDBK 细胞的时间越长，细胞的生长状态越差。依据检测结果，选择1、2.5、5、10、20 mg·L-1作为下一步细胞活性检测所用的C12cmpC 浓度参考范围。

图1 不同浓度氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺作用不同时间时MDBK 细胞的形态（100×）Fig.1 Morphology of MDBK cells treated with different concentrations of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide for different time（100×）

2.4 C12cmpC 对MDBK 细胞活性的影响

选取浓度为1、2.5、5、10、20 mg·L-1的C12cmpC溶液作用MDBK 细胞，不加C12cmpC 的MDBK 细胞为对照。各试验组细胞培养72 h，通过CCK-8 细胞增殖检测试剂盒检测MDBK 细胞的存活率。结果显示，当C12cmpC 浓度为10 mg·L-1（P＜0.001）和20 mg·L-1（P＜0.001）时，MDBK 细胞的存活率显著下降。依据结果（图2），选定5 mg·L-1为C12cmpC 对MDBK 细胞的最大安全浓度。

图2 不同浓度氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺对MDBK 细胞存活率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of chlorinated-Ndodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide on survival rate of MDBK cells

2.5 C12cmpC 抗BVDV 活性检测

选取5 mg·L-1的C12cmpC 与BVDV 分别作用1、5、30、60 min。处理后的病毒液加入MDBK 细胞中培养72 h，qRT-PCR 检测BVDV mRNA 的表达水平。结果如图3 所示，C12cmpC 处理后BVDV mRNA的表达水平显著降低（1 min，P＜0.05；
5 min，P＜0.05；
30 min，P＜0.01；
60 min，P＜0.01）。

图3 氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺对BVDV mRNA 表达水平的影响Fig.3 Effect of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide on the expression level of BVDV mRNA

消毒剂的使用在畜禽养殖场的疫病防控中占据至关重要的地位，消毒效果的好坏直接影响养殖场的经济效益。季铵盐类消毒剂因其低毒性、低腐蚀性、高效且广谱抑菌等优点得到广泛的关注和应用，对多种细菌的杀灭作用和抗病毒功能也被逐渐发现。苯扎氯铵是季铵盐类消毒剂的第一代产品，当浓度为1 000 mg·L-1时，作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌2 min，可以杀灭99.8%和99.9%的细菌[20]。同样为单链季铵盐类消毒剂的十八烷基三甲基氯化铵对大肠杆菌的MIC 为125 mg·L-1[21]。双链季铵盐类消毒剂双癸基二甲基氯化铵对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 均为400 mg·L-1[22]。研究中C12cmpC 对大肠杆菌（ATCC 10536）和金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）标准株的MIC 均为31.25 mg·L-1，以62.5 mg·L-1的浓度作用1 min 时，即可达到99.9%以上的杀菌率，C12cmpC 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值更小。然而，试验中C12cmpC 对10 株分离菌株的杀菌活性低于标准菌株。后续临床试验时，应根据实际情况相应地提高浓度进行检测与分析。

季铵盐消毒剂主要通过作用于生物膜来发挥作用，可杀灭有囊膜的病毒[23]。BVDV 含有囊膜，是影响养牛业经济的重要病毒[24]。研究发现，C12cmpC 对BVDV 作用1 min，可以显著抑制BVDV 复制，具有抗BVDV 的作用。此外，程晶等[25]在探究多种消毒剂对非洲猪瘟病毒的灭活作用中发现，季铵盐消毒剂苯扎溴铵对猪原代肺泡巨噬细胞的最高安全浓度为2.5 mg·L-1。Verena 等[26]研究发现，苯扎氯铵对斑马鱼肝细胞和人肝细胞活力的半数效应浓度分别为8.5×10-4mg·L-1和2.74×10-3mg·L-1。试验中C12cmpC 对MDBK 细胞的最大安全浓度为5 mg·L-1。在保证较高的抗病毒活性下避免了C12cmpC 对MDBK 细胞活性的不良影响，这为后续深入探索C12cmpC 抗病毒作用提供了依据。

目前，季铵盐类消毒剂已经发展到了第七代，仅通过改变季铵盐类化合物的结构来增强消毒剂的杀菌效果越来越难，并且这种方式的研发成本也相对较高。将季铵盐类消毒剂复配其他种类消毒剂，制备新型复合消毒剂逐渐成为消毒剂开发领域新的发展趋势[9]。多种消毒剂成分的复配，不仅能够弥补单一消毒剂组分杀菌效果不足的缺点，也能通过产生协同作用增强复合消毒剂的杀菌效果。刘欢等[27]在评估一种季铵盐和醛类的复合消毒剂时发现，复合消毒剂不仅能够减弱醛类的毒性和刺激性，还能提高杀菌效果，并且能杀灭新城疫病毒和猪瘟病毒。此外，由于季铵盐类化合物属于阳离子表面活性剂，不能与阴离子表面活性剂和氧化剂同时使用，也不能接触拮抗剂和有机物[28]。总之，开发低毒、高效、杀菌作用持久的季铵盐类表面活性剂消毒剂，对于畜禽养殖场的临床消毒具有重要意义。

季铵盐类表面活性剂氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（C12cmpC）对禽源致病菌（大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌）和牛病毒性腹泻病毒均有杀灭作用，研究结果为C12cmpC 的临床应用和新型季铵盐类消毒剂的开发提供了依据。

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