栀子醇提物下调lncRNA,MALAT1影响帕金森病模型细胞增殖和凋亡

丛向阳 向艳丽 陈静

(威海市立第三医院 1药剂科,山东 威海 264200;2公共卫生科;3西药房)

帕金森病(PD)是影响中老年人健康的第二大神经性神经退行性疾病,以大脑黑质中多巴胺能神经元的逐渐丧失,继而引发运动功能障碍及一系列非运动症状为特征〔1〕。虽然多巴胺激动剂、单胺氧化酶B抑制剂可缓解PD的运动症状,但并不能阻止疾病进展或逆转神经退行性变,且长期服用具有较大的副作用〔2〕。栀子为茜草科植物栀子的干燥成熟果实,除用作天然黄色染料外,其还具有抗氧化、降血糖、抑制炎症、抗抑郁、改善睡眠质量等多种生物活性〔3〕。栀子醇提物可降低PD小鼠的爬杆时间,具有较好的多巴胺能神经元保护作用〔4〕。近年来,长链非编码RNA(lncRNA)在神经发育、再生和神经退行性疾病过程中的作用已成为研究热点。有研究指出lncRNA肺癌转移相关转录本(MALAT)1在PD模型小鼠脑组织中表达增加并诱导多巴胺能神经细胞凋亡〔5〕。然而,栀子醇提物是否通过调控lncRNA MALAT1表达进而对PD神经元损伤具有保护作用并不清楚。本研究以1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞构建PD细胞模型〔6〕,探讨栀子醇提物对PD模型细胞活力、凋亡的影响,分析其潜在作用机制,以期为开发栀子醇提物用于防治PD提供理论依据。

1.1细胞和主要试剂 人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH购于武汉普诺赛生命科技公司;MPP+购于美国Sigma公司;MALAT1小干扰RNA(si-MALAT1)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、空载体质粒(pcDNA)、MALAT1过表达质粒(pcDNA-MALAT1)由广州复能基因公司提供;细胞计数试剂盒(CCK-8)购于日本同仁公司;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购于上海钰博生物公司;山羊抗兔IgG二抗及兔抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体、兔抗人Bcl相关X蛋白(Bax)抗体、兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购于上海碧云天生物公司;逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix购于美国ABI公司。

1.2栀子醇提物制备 参照张奇昌等〔4〕实验方法进行,将2 kg栀子干燥果实粉碎,60%乙醇冷浸,收集提取液,负压抽滤除去杂质,减压浓缩后,冷冻干燥得到栀子醇提物。

1.3实验分组 用含10%胎牛血清的MEM培养液在37 ℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养SK-N-SH细胞。以正常培养的SK-N-SH细胞作为对照组;用3 mmol/L的MPP+处理SK-N-SH细胞18 h作为PD细胞模型〔6〕,记为模型组;用浓度分别为25、50、100 μg/ml的栀子醇提物预处理4 h后再用3 mmol/L的MPP+处理,依次记为实验1组、实验2组、实验3组。利用Lipofectamine2000将si-NC、si-MALAT1分别转染至SK-N-SH细胞后再用3 mmol/L的MPP+处理依次记为si-NC组、si-MALAT1组。利用Lipofectamine2000将pcDNA、pcDNA-MALAT1分别转染至SK-N-SH细胞后用100 μg/ml的栀子醇提物预处理4 h及3 mmol/L的MPP+处理依次记为实验3+pcDNA组、实验3+pcDNA-MALAT1组。

1.4CCK-8检测细胞活力 将各组细胞以1×104个/孔密度接种96孔板,每孔加入10 μl的CCK-8试剂,进一步孵育4 h后,分光光度法吸光度测量各孔在450 nm处光密度(OD)值。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次,随后用结合缓冲液调整密度为1×106个/ml细胞悬液。采用Annexin Ⅴ-FITC和PI进行染色,流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.6Western印迹检测Bax和Bcl-2蛋白表达 RIPA裂解液提取各组细胞蛋白质,随后进行蛋白浓度测定。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂牛奶封闭膜,将膜与兔抗Bax、Bcl-2或GAPDH抗体孵育过夜,然后用山羊抗兔二抗孵育膜2 h。化学发光试剂检测条带,以内参和目的蛋白灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.7实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测lncRNA MALAT1表达 用Trizol试剂从各组细胞中提取总RNA,逆转录试剂盒进行逆转录反应,使用SYBR Premix master mix进行RT-qPCR。以GAPDH为内源对照,2-ΔΔCt方法计算lncRNA MALAT1相对表达水平。MALAT1上游引物5′-TGCG AGTTGTTCTCCGTCTA-3′,下游5′-TATCTGCGGTT TCCTCAAGC-3′;GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游5′-AAGTGGTCGTTGAGG GCAATG-3′。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0进行独立样本t检验、单因素方差分析和LSD-t检验。

2.1栀子醇提物对PD模型细胞活性的影响 与对照组比较,模型组细胞活力显著降低(P<0.05);与模型组比较,实验2、实验3组细胞活力显著升高(P<0.05)。且实验1、实验2、实验3组两两比较细胞活力差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 栀子醇提物对PD模型细胞活性、凋亡、MALAT1表达的影响

2.2栀子醇提物对PD模型凋亡的影响 与对照组比较,模型组细胞Bax蛋白表达、凋亡率显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,实验2、实验3组细胞Bax蛋白表达、凋亡率显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。且实验1、实验2、实验3组间各项指标两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1、图2。

图1 栀子醇提物对PD模型细胞凋亡的影响

1～9:对照组、模型组、实验1组、实验2组、实验3组、si-NC组、si-MALAT1组、实验3+pcDNA组、实验3+pcDNA-MALAT1组

2.3栀子醇提物对PD模型细胞MALAT1表达的影响 与对照组比较,模型组细胞中MALAT1表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,实验2、实验3组细胞MALAT1表达显著降低(P<0.05)。且实验1、实验2、实验3组间MALAT1表达两两比较差异有统计学意义。见表1。

2.4抑制MALAT1表达对PD模型细胞活性及凋亡的影响 与si-NC组比较,si-MALAT1组细胞中MALAT1表达水平显著降低,Bcl-2蛋白表达和细胞活力显著升高,Bax蛋白表达和凋亡率显著降低(P<0.05)。见图2、图3、表2。

图3 抑制MALAT1对PD模型凋亡率的影响

表2 抑制MALAT1对PD模型细胞活性及凋亡蛋白的影响

2.5过表达MALAT1对栀子醇提物处理的PD模型细胞活性的影响 与实验3+pcDNA组比较,实验3+pcDNA-MALAT1组细胞中MALAT1表达显著升高,细胞活力显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 过表达MALAT1对栀子醇提物处理的PD模型组细胞活性、凋亡率及凋亡蛋白的影响

2.6过表达MALAT1对栀子醇提物处理的PD模型细胞凋亡的影响 与实验3+pcDNA组比较,实验3+pcDNA-MALAT1组细胞Bax蛋白表达和凋亡率显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2、表3、图4。

图4 过表达MALAT1对栀子醇提物处理的PD模型组细胞凋亡率影响

栀子的神经保护作用已被广泛报道。Zhang等〔7〕研究发现,栀子醇提物可显著提高脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)含量,抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)和一氧化氮合酶(NOS),改善慢性脑缺血模型大鼠学习记忆。Zang等〔8〕指出,藏红花素能增强抗氧化能力,减轻神经炎症,增强了阿尔茨海默病(AD)模型小鼠的记忆和认知能力。此外,Yuan等〔9〕证实,栀子苷通过抑制丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/核因子(NF)-κB通路可维持血脑屏障完整性,降低脑水肿,抑制促炎因子分泌对创伤性脑损伤具有保护作用。本研究表明,栀子醇提物呈剂量依赖效应提高模型细胞活力,抑制模型细胞凋亡。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之间的平衡在调控细胞凋亡中起重要作用,Bax表达增加可促进线粒体膜孔形成,导致细胞色素c等促凋亡因子释放进入细胞质,进而激活半胱天蛋白酶(Caspase)途径,促进细胞凋亡,而Bcl-2则通过阻止Bax移位线粒体外膜和构象改变具有抗凋亡作用〔10〕。研究证实,MPP+处理可干扰Bax和Bcl-2之间的平衡,促进多巴胺能神经元细胞凋亡〔11,12〕。本研究发现模型细胞中Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低,而一定剂量栀子醇提物可显著逆转MPP+引起的Bax和Bcl-2表达改变。以上研究结果表明,栀子醇提物可促进PD模型细胞增殖,抑制细胞凋亡,即栀子醇提物具有潜在的PD保护作用。

研究表明,lncRNA是由长度大于200个核苷酸组成的RNA转录本,其在转录、表观遗传和转录后水平参与调节神经发育、神经分化、突触功能等多种生物学过程,在PD发病过程中具有重要作用〔13〕。研究显示,癫痫大鼠脑组织中lncRNA MALAT1表达增加,并具有诱导细胞凋亡及神经元损伤作用〔14〕。黄连素通过抑制lncRNA MALAT1表达影响miR-181c-5p/高迁移率族蛋白(HMG)B1途径降低脑缺血后的炎症损伤〔15〕。然而,脊髓损伤、AD等疾病中lncRNA MALAT1表达降低,过表达lncRNA MALAT1可抑制神经元凋亡和损伤〔16～18〕。本研究显示,PD模型细胞中lncRNA MALAT1表达显著升高,而栀子醇提物呈剂量依赖方式降低PD模型细胞中lncRNA MALAT1表达水平。转染si-MALAT1进行功能验证显示,抑制lncRNA MALAT1可提高PD模型细胞活力和Bcl-2蛋白水平,降低细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平。进一步研究显示,转染pcDNA-MALAT1过表达lncRNA MALAT1可显著逆转栀子醇提物对PD模型细胞活力、凋亡及Bax和Bcl-2蛋白的影响。以上研究结果表明,抑制lncRNA MALAT1表达是栀子醇提物对PD模型细胞发挥保护作用的重要途径。

综上,栀子醇提物可促进PD模型细胞增殖,抑制细胞凋亡,其机制与下调lncRNA MALAT1表达有关,这丰富了栀子醇提物的神经保护作用机制,为开发栀子醇提物用于防治PD提供理论依据。

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