不同醇化卷烟原料表面微生物的群落结构及对大分子物质的降解功能

陈善义，陈千思，刘金燕，陈义强，范坚强，邓小华，李菁菁，陶界锰*

1. 福建中烟工业有限责任公司技术中心，厦门市集美区滨水路298 号 361021

2. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

烟叶中蛋白质、淀粉、纤维素、果胶和木质素等大分子物质的含量与烟叶品质紧密相关［1］，含量过高会降低烟叶品质［2-6］。醇化是提高烟叶品质的重要手段。醇化过程中片烟表面微生物种类丰富，且主要为细菌［7-8］，这些细菌可通过分泌不同种类的降解酶，将醇化片烟中的蛋白质、淀粉、纤维素、果胶和木质素等大分子物质转化为对吸食品质有利的小分子物质，提高醇化片烟的品质［9-11］。目前，有关醇化烤烟片烟表面微生物的群落结构及对含碳、含氮有机化合物的降解功能已有报道。Zhou等［7］研究了不同醇化阶段的片烟表面微生物的群落结构，并鉴定出参与含碳、含氮有机化合物降解的微生物；
吴鑫颖［12］研究了不同香型、不同质量等级片烟在醇化过程中表面微生物群落结构的变化，并分析了优势菌属在碳水化合物降解方面的功能。然而，关于醇化烤烟烟梗和香料烟等醇化卷烟原料表面微生物的群落结构和对大分子物质的降解功能的研究还鲜见报道。因此，采用宏基因组测序技术，分析醇化2 年的烤烟烟梗、香料烟和烤烟片烟表面微生物的群落结构及对大分子物质的降解功能，挖掘与大分子物质降解相关的微生物种类，以期为醇化卷烟原料表面微生物资源的利用提供理论基础。

1.1 试验材料、试剂和仪器

材料：供试的3种卷烟原料分别为厦门烟草工业有限责任公司仓库中醇化2年的烤烟烟梗、香料烟以及龙岩烟草工业有限责任公司仓库中醇化2 年的烤烟片烟，产地均为云南。每种醇化卷烟原料选取6箱，并于每箱的中心位置取500 g 作为醇化样品，共计18份。

试剂：E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒（美国Omega Bio-tek 公司）；
DL 5000 DNA marker（北京擎科生物科技有限公司）；
10×PBS 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；
NEB Next®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒（美国New England Biolabs公司）。

仪器：FrescoTM17 型微量离心机、NanoDropTMOne/OneC 型超微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
770R 型回转式振荡恒温培养箱（美国APLUS 公司）；
FluorChem R 型全自动荧光与可见光凝胶成像分析仪（美国Protein Simple 公司）；
AMD06-2-1.5+型磁力架（深圳市奥美顿科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物的分离和富集

醇化样品表面微生物的分离和富集参照文献［13］中的方法进行。具体步骤：取15.0 g 醇化样品置于1 000 mL 无菌塑料瓶中，加入350 mL 1×PBS缓冲液（10×PBS 用ddH2O 稀释10 倍）、2.0 g 无菌石英砂和15 个无菌玻璃珠（直径6 mm）后在低温摇床中振荡，洗脱醇化样品表面的微生物。用无菌纱布过滤洗脱后的液体，再用无菌微孔滤膜［孔径0.22 μm，直径50 mm，生工生物工程（上海）股份有限公司］富集微生物。将收集的滤膜置于50 mL 无菌离心管中，加入15 个无菌钢珠（直径6 mm）和5 mL 1×PBS缓冲液，振荡洗脱滤膜表面的微生物。将洗脱液转移至1.5 mL无菌离心管中，2 000 r/min 离心2 min后转移上清液至新的1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心3 min后收集微生物沉淀。

1.2.2 微生物总DNA 抽提、质量检测及宏基因组测序

将1.2.1 节中收集的微生物沉淀置于1.5 mL 无菌离心管中，使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒并按照其说明书进行微生物总DNA 提取。使用1%（质量分数）琼脂糖凝胶对获得的微生物总DNA 进行电泳检测，使用NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度计检测DNA 浓度和纯度。使用NEB Next®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒并按照其说明书对DNA进行文库构建，然后将DNA 文库样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行宏基因组测序。

1.2.3 宏基因组数据处理及分析

使用FastQC 软件对原始测序数据进行质量评估；
使用Trimmomatic软件对原始测序数据进行质控后得到质控数据（Clean reads），将质量得分大于Q30（错误率≤0.1%）的序列通过IDBA_UD 组装工具进行拼接组装；
使用Prodigal软件对拼接结果进行开放阅读框（ORF）预测。使用Bowtie2和SAMtools 软件将预测的ORF 与非冗余基因集进行比对，并计算基因在各醇化样品表面微生物群落中的相对丰度。对预测出的基因使用NR（Non-Redundant Protein Sequence）数据库进行物种注释，使用eggNOG（evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）数据库进行COG（Clusters of Orthologous Groups）功能注释，使用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行KEGG 功能注释，使用CAZy（Carbohydrate-Active enZYmes）数据库进行碳水化合物活性酶注释［14］。

1.2.4 大分子物质含量检测

参照YC/T 346—2010［15］中的方法测定醇化样品的果胶含量（质量分数）；
参照YC/T 347—2010［16］中的方法测定醇化样品的纤维素和木质素含量（质量分数）；
参照YC/T 216—2013［17］中的方法测定醇化样品的淀粉含量（质量分数）；
采用考马斯亮蓝法［18］测定醇化样品的蛋白质含量（质量分数）。

1.2.5 数据统计和分析

使用SPSS 26.0软件进行数据处理与统计分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）中的最小显著差数法（LSD）比较数据间的显著性差异。使用RStudio 4.0.4 软件中的vegan 程序包计算微生物群落的Shannon 和Simpson 多样性指数。使用RStudio 4.0.4软件计算大分子物质含量与微生物相对丰度（相对丰度大于1%）间的皮尔逊（Pearson）相关系数［19］。

2.1 不同醇化卷烟原料大分子物质含量

3种醇化卷烟原料中，果胶含量醇化烤烟烟梗最高，醇化烤烟片烟最低；
纤维素含量醇化香料烟最高，醇化烤烟片烟最低；
淀粉和蛋白质含量醇化香料烟均最高，醇化烤烟烟梗最低；
木质素含量醇化烤烟烟梗最高，醇化烤烟片烟最低（图1）。

图1 不同醇化卷烟原料5种大分子物质含量Fig.1 Contents of five macromolecular substances in different aged cigarette raw materials

2.2 不同醇化卷烟原料表面微生物群落多样性及群落结构

2.2.1 α多样性

在属水平上对3 种醇化卷烟原料表面微生物群落的多样性进行分析，结果如图2所示。醇化香料烟表面微生物群落的Shannon 指数和Simpson 指数最大，多样性最高，与醇化烤烟片烟存在显著差异，而醇化烤烟烟梗与醇化香料烟和醇化烤烟片烟间的差异均不显著。

图2 不同醇化卷烟原料表面微生物多样性指数Fig.2 Diversity indexes of microorganisms communities on different aged cigarette raw materials

2.2.2 群落结构

18份醇化样品共鉴定出2 344个菌属，不同醇化样品属水平的物种相对丰度如图3所示。所有醇化样品的微生物群落均以细菌为主，细菌相对丰度之和为93.88%～99.25%。醇化烤烟烟梗的优势菌属为泛菌属（Pantoea，1.42%～73.96%）、不动杆菌属（Acinetobacter，1.38%～29.61%）、克雷伯氏菌属（Klebsiella，1.58%～26.92%）和假单胞菌属（Pseudomonas，0.55%～6.00%）；
醇化香料烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea，24.46%～38.98%）、假单胞菌属（Pseudomonas，10.12%～21.29%）和不动杆菌属（Acinetobacter，2.01%～6.60%）；
醇化烤烟片烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea，1.55%～63.72%）、芽孢杆菌属（Bacillus，9.51%～52.75%）和土地芽孢杆菌属（Terribacillus，1.26%～10.70%）。

图3 不同醇化卷烟原料表面微生物（属水平）相对丰度Fig.3 Relative abundances of surface microorganism（at genus level）on different aged cigarette raw materials

2.3 醇化卷烟原料大分子物质含量和表面微生物相对丰度相关性

根据各醇化样品在属分类水平的物种注释及相对丰度信息，选取平均相对丰度排名前25 的菌属与醇化样品蛋白质、淀粉、纤维素、木质素和果胶含量进行相关分析，结果如表1 所示。相对丰度与蛋白质、淀粉、纤维素和果胶含量显著相关的菌属共计12个，未发现与木质素含量显著相关的菌属。微球黑粉菌属（Microbotryum）的相对丰度与蛋白质含量显著正相关，根霉菌属（Rhizopus）、大肠杆菌属（Escherichia）、鲍特菌属（Bordetella）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、肠球菌属（Enterococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）的相对丰度均与蛋白质含量显著负相关。微球黑粉菌属（Microbotryum）的相对丰度与淀粉含量显著正相关，大肠杆菌属（Escherichia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）的相对丰度均与淀粉含量显著负相关。微球黑粉菌属（Microbotryum）的相对丰度与纤维素含量显著正相关。根霉菌属（Rhizopus）、大肠杆菌属（Escherichia）、鲍 特 菌 属（Bordetella）、寡 养 单 胞 菌 属（Stenotrophomonas）、肠球菌属（Enterococcus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度均与果胶含量显著正相关，土壤芽孢杆菌属（Terribacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）的相对丰度均与果胶含量显著负相关。

表1 微生物（属水平）相对丰度与醇化样品蛋白质、淀粉、纤维素和果胶含量的相关性①Tab.1 Correlations between relative abundances of microorganisms（at genus level）and the contents of protein，starch，cellulose，and pectin in the aged samples

2.4 不同醇化卷烟原料表面微生物基因功能

2.4.1 COG和KEGG功能注释

对宏基因组测序数据进行ORF 预测，醇化烤烟烟梗、醇化香料烟和醇化烤烟片烟样品分别预测出约16 万个、25 万个和8 万个微生物基因，平均长度为613 479 bp。由图4 可见，3 种醇化卷烟原料宏基因组测序数据的COG 注释结果和KEGG 注释结果整体类似，醇化卷烟原料表面微生物基因功能多与物质转运和代谢相关。COG 注释结果表明醇化卷烟原料表面微生物基因功能主要包括氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢以及无机离子转运和代谢；
KEGG 注释结果表明醇化卷烟原料表面微生物基因功能主要包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、辅酶因子和维生素代谢及核酸代谢。

图4 不同醇化卷烟原料表面微生物功能基因的相对丰度Fig.4 Relative abundances of functional genes of surface microorganisms on different aged cigarette raw materials

2.4.2 碳水化合物活性酶基因数量

将宏基因组测序数据进行碳水化合物活性酶注释后，统计不同醇化卷烟原料样品表面微生物的各类碳水化合物活性酶基因数量，结果如图5 所示。3种醇化卷烟原料表面微生物群落的碳水化合物活性酶基因中，糖苷水解酶基因数量最多，其次是糖基转移酶基因、糖类酯解酶基因和氧化还原酶基因，多糖裂解酶基因数量最少。对3 种醇化卷烟原料表面微生物群落的碳水化合物活性酶基因数量进行比较，发现醇化香料烟氧化还原酶基因数量显著高于醇化烤烟烟梗和醇化烤烟片烟；
任2种醇化卷烟原料间糖类酯解酶和糖苷水解酶基因数量均无显著差异；
醇化香料烟糖基转移酶和多糖裂解酶基因数量显著高于醇化烤烟片烟，而醇化烤烟烟梗与醇化香料烟、醇化烤烟片烟间均无显著差异。

图5 不同醇化卷烟原料表面微生物的碳水化合物酶基因数量Fig.5 Numbers of CAZyme genes of surface microorganisms on different aged cigarette raw materials

2.4.3 大分子物质降解关键酶基因数量

内肽酶（Endopeptidase）和外肽酶（Exopeptidase）是蛋白质降解的关键酶［20］。由表2 可见，相对丰度与醇化样品蛋白质含量显著负相关的菌属中含有的外肽酶基因多于内肽酶基因，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）的外肽酶和内肽酶基因较多，表明这些菌属具有较强的蛋白质降解能力。

表2 相对丰度与醇化样品蛋白质含量负相关菌属中蛋白质降解关键酶基因数量Tab.2 Numbers of key enzyme genes involved in protein degradation in bacterial genera whose relative abundance was negatively correlated with protein content in the aged samples（个）

α-淀粉酶（Alpha-amylase）和α-葡萄糖苷酶（Alpha-glucosidase）是水解淀粉主链的关键酶，支链淀粉酶（Pullulanase）是水解淀粉支链的关键酶［21］。由表3可见，相对丰度与醇化样品淀粉含量显著负相关的菌属中，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）含有较多α-淀粉酶基因，表明鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）具有较强的淀粉降解能力。

表3 相对丰度与醇化样品淀粉含量负相关菌属中淀粉降解关键酶基因数量Tab.3 Numbers of key enzyme genes involved in starch degradation in bacterial genera whose relative abundance was negatively correlated with starch content in the aged samples（个）

果胶酯酶（Pectinesterase）、多聚半乳糖醛酸（内切）酶（Polygalacturonase）和半乳糖醛酸1，4-α-半乳糖醛酸酶（Galacturan 1，4-alpha-galacturonidase）是果胶降解的关键酶［22］。由表4 可见，相对丰度与醇化样品果胶含量显著负相关的菌属中，仅有芽孢杆菌属（Bacillus）含有11 个果胶酯酶基因，表明芽孢杆菌属（Bacillus）具有较强的果胶降解能力。

表4 相对丰度与醇化样品果胶含量负相关菌属中果胶降解关键酶基因数量Tab.4 Numbers of key enzyme genes involved in pectin degradation in bacterial genera whose relative abundance was negatively correlated with pectin content in the aged samples（个）

醇化2年后，香料烟中纤维素、淀粉、蛋白质和木质素含量均高于烤烟烟梗和烤烟片烟，且香料烟的微生物群落多样性最高，推测原因是醇化香料烟含有的纤维素、淀粉、蛋白质和木质素等大分子物质较多，为微生物的生长提供了更多营养。醇化烤烟烟梗的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和假单胞菌属（Pseudomonas），仅假单胞菌属（Pseudomonas）与李易非等［23］报道的醇化烤烟烟梗优势菌属一致，部分不一致的优势菌属如链霉菌属（Streptomyces）、甲基杆菌属（Methylobacterium）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）在本研究中不是优势菌属，可能是醇化时间不同所致。本研究中醇化烤烟片烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Bacillus）和土地芽孢杆菌属（Terribacillus），这与Liu等［24］报道的醇化烤烟片烟表面的优势菌属相似，但与龚俊［25］报道的醇化烤烟片烟表面的优势菌属不一致，可能是产区不同所致。

在醇化烤烟烟梗、香料烟和烤烟片烟表面发现多个相对丰度与醇化样品淀粉、蛋白质及果胶含量显著负相关的菌属，推测这些菌属在淀粉、蛋白质或果胶降解中具有重要作用，这与Tao 等［26］报道的研究结果相似。在相对丰度与醇化样品淀粉含量显著负相关的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）中鉴定出大量淀粉降解关键酶基因，证明鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）具有淀粉降解功能，这与Akter 等［27］报道的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）分泌的酶能够降解淀粉的结果一致。在相对丰度与醇化样品蛋白质含量显著负相关的菌属中，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）含有较多蛋白质降解关键酶基因，表明这些菌属具有蛋白质降解功能，这与Geueke 等［28］和Peng 等［29］的研究结果一致。在相对丰度与醇化样品果胶含量显著负相关的菌属中，芽孢杆菌属（Bacillus）含有较多果胶降解关键酶基因，该菌属在醇化烤烟片烟中的相对丰度最高，且醇化烤烟片烟中果胶含量最低，说明芽孢杆菌属（Bacillus）参与醇化烤烟片烟中果胶的降解，这与黄晨奕等［30］报道的芽孢杆菌属（Bacillus）能显著降低烟叶中果胶含量的结果相符。

醇化2年的烤烟烟梗、香料烟和烤烟片烟表面共鉴定出2 344 个菌属。醇化烤烟烟梗的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和假单胞菌属（Pseudomonas），醇化香料烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter），醇化烤烟片烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Bacillus）和土地芽孢杆菌属（Terribacillus）。与醇化样品淀粉、蛋白质和果胶含量显著负相关的菌属分别有3个［大肠杆菌属（Escherichia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）］、8 个［根霉菌属（Rhizopus）、大肠杆菌属（Escherichia）、鲍 特 菌 属（Bordetella）、寡 养 单 胞 菌 属（Stenotrophomonas）、肠球菌属（Enterococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）］和2 个［土壤芽孢杆菌属（Terribacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）］。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）具有较强的淀粉降解能力，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）具有较强的蛋白质降解能力，芽孢杆菌属（Bacillus）具有较强的果胶降解能力。

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