迷迭香酸-锌配合物的抗氧化和抗菌性研究

蒋骋昊，卞晶晶，谢海峰*

1南京医科大学口腔医学院，江苏 南京 210029；
2南京医科大学附属口腔医院修复科，江苏省口腔疾病研究重点实验室，江苏省口腔转化医学工程研究中心，江苏 南京 210029

从天然植物中提取的酚类化合物，因其强大的抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等生物活性而受到广泛关注，作为天然来源的抗氧化剂具有极大的生物和经济利用价值［1-2］。由于羧基或羟基的存在，酚类化合物可以与金属离子配合形成络合物，优先结合位点受多酚结构、金属离子类型和周围介质酸碱度的影响［3］。已经发现配合物的生物学性质在络合时增强，配合物具有比游离配体更高的生物学效应［4］。例如桑黄素与氧钒（oxovanadium，IV）络合后提高了对超氧自由基和羟基自由基的清除活性［5］。木犀草素-铁配合物具有增强的抗氧化和抗炎活性［6］。由此可见，金属离子与多酚络合是提高多酚生物活性和生物利用度的重要途径。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）常见于迷迭香、鼠尾草、薄荷等植物中，是一种具有1个羧基、2个带有邻苯二酚结构的苯环（A和A’）、不饱和碳碳双键和酯基团的酚酸［7］。RA的生物活性包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤和神经保护等，通过清除自由基和活性氧在生物系统中表现出强大的抗氧化能力，其抗氧化性高于维生素E［8］。比较多种羟基肉桂酸衍生物的抗氧化性，RA 活性最高（RA>绿原酸>咖啡酸>阿魏酸>香豆酸）［9］。RA通过减少小鼠单侧输尿管梗阻侧肾皮质脂质过氧化物的产生而发挥抗氧化应激作用，改善肾间质纤维化［10］。RA 通过调节NF-κB 和JNK、MAPK 信号通路来改善脂多糖诱导的炎症［11］；
可能通过抑制机体炎症水平和纠正免疫功能紊乱的途径，加速大鼠口腔溃疡的愈合［12］。同时RA对多种细菌具有抑制和杀伤作用，如表皮葡萄球菌、葡萄球菌、粪肠球菌等［13］。

金属离子是人体不可或缺的元素，参与机体各种活动，其中锌（zinc，Zn）参与2 000 多种转录因子的构成，并作为300多种酶的辅助因子［14］。Zn直接或间接介导抗氧化作用，可以结合蛋白质和肽中的硫醇和巯基，保护脂质双分子层免受氧化，稳定细胞膜［15］。Zn还参与骨细胞的能量代谢，可刺激成骨细胞增殖分化，促进胶原蛋白合成，抑制破骨细胞骨吸收而发挥理想的成骨活性［16］。抗菌性是Zn最为熟知的特性［17］。已发现多种多酚与Zn离子螯合后，生物活性增强，如槲皮素-Zn配合物增强了抗氧化性，绿原酸与Zn络合后抗氧化和抗菌水平提高［18-19］。RA 具有可以和Zn 离子结合的羧酸和邻苯二酚结构，据此推测RA和Zn离子络合后可能会增强抗氧化性和抗菌性，并促进成骨细胞增殖。

本研究合成了RA 与Zn 的配合物（RA-Zn），并利用扫描电镜、红外光谱和紫外-可见光谱分析合成前后的结构。选定4 种多酚（漆黄素、荭草苷、RA、丹参酚酸B），利用细胞增殖实验评价它们对成骨细胞的增殖作用，同时评价RA-Zn 和RA 的促细胞增殖作用、抗氧化性和抗菌性，为探究RA-金属配合物的生物活性机制提供参考。

1.1 材料

RA（纯度>95%）、氯化锌（ZnCl2）（上海麦克林公司）；
CCK-8 试剂盒（Cell Counting Kit-8，Dojido 公司，日本）；
α-MEM 培养基（Gibco公司，美国）；
4%青霉素和链霉素（杭州碧云天公司）；
胎牛血清（FBS，ExCell 公司，乌拉圭）；
LB 液体培养基（上海阿拉丁公司）；
小鼠颅骨前成骨细胞系MC3T3-E1（中国科学院上海细胞所）；
金黄色葡萄球菌S.aureus（ATCC 25923，南京医科大学江苏省口腔疾病研究重点实验室样本库）；
总抗氧化能力检测试剂盒2，2-联氮-二-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐［2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS］（杭州碧云天公司）；
扫描电子显微镜（MAIA3，TESCAN 公司，捷克）；
微孔板分光光度计（PerkinElmer，Waltham公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 RA-Zn的合成

RA溶于10 mL无水乙醇中，使其浓度为0.01 mol/L，加入0.01 mol/L 的ZnCl2水溶液5 mL，采用NaOH 调节pH为8.5，室温下反应24 h，3 500 r/min离心10 min，去除上清液，无水乙醇洗涤3次后，干燥得到RA-Zn。

1.2.2 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察

利用SEM拍摄RA和RA-Zn的表观图像。

1.2.3 红外光谱分析

使用溴化钾（KBr）将样品制备为颗粒，并在400～4 000 cm-1范围内监测RA和RA-Zn的红外光谱。

1.2.4 紫外-可见光谱分析

利用NanoDrop 紫外光分光光度计记录RA 及RA-Zn 的紫外可见光谱。采用摩尔比法确定Zn 离子与RA 的摩尔比。RA 和ZnCl2溶解于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液（pH=8.5）中，浓度为0.01 mol/L，通过保持RA的量不变而改变Zn离子摩尔量，使摩尔比［RA］∶［ZnCl2］=1∶0、10∶3、5∶2、2∶1、5∶3、20∶13、10∶7、5∶4、20∶17、10∶9、20∶19、1∶1、2∶3、5∶9、1∶2，记录具有不同摩尔比溶液的光谱。

1.2.5 细胞增殖实验

将MC3T3-E1 细胞以3 000 个/孔的密度分别接种在具有不同浓度（0、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L）的漆黄素、荭草苷、RA、丹参酚酸B的96孔板中，培养1、3 d 后吸出培养液，每孔加入100 μL含10%CCK-8的新鲜培养基，避光孵育2 h，在450 nm波长下测量吸光度值。以同样的方法检测RA和RA-Zn（100 μmol/L）培养1、3、5 d后的成骨细胞增殖情况。

1.2.6 ABTS法检测RA和RA-Zn的抗氧化活性

分别取10 μL 200 μmol/L 的RA 和RA-Zn 与170 μL ABTS 工作溶液反应6 min。用微孔板分光光度计测量414 nm 处的吸光度值。使用浓度为0.15～1.50 mmol/L 的水溶性维生素E（Trolox）标准溶液建立标准曲线，比较样品的抗氧化能力。

1.2.7 铁还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定检测RA 和RA-Zn 的抗氧化活性

分别取5 μL 200 μmol/L浓度的RA和RA-Zn与180 μL FRAP 工作溶液反应5 min。用微孔板分光光度计测量593 nm 处的吸光度值。使用浓度为0.15～1.50 mmol/L 的FeSO4水溶液建立标准曲线，计算样品的抗氧化活性。

1.2.8 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）法检测RA和RA-Zn的抑菌作用

采用MIC 法研究了RA 和RA-Zn 对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）生长的抑制作用。100 μL金黄色葡萄球菌（浓度为1×106CFU/mL）分别与100 μL不同浓度的RA 和RA-Zn 一起接种在96 孔板中，并在37 ℃、120 r/min 条件下孵育24 h。孵育后，在分光光度计中测量600 nm处的吸光度值。

1.3 统计学方法

所有实验数据使用GraphPad Prism8 和Origin软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey’s 或Dunnett’s 检验。所有实验至少重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 合成的RA-Zn的结构

RA 是由1 个羧基、2 个带有邻苯二酚结构的苯环、不饱和碳碳双键和酯基团组成，其中羧基和邻苯二酚结构参与Zn2+络合，RA-Zn的可能结构如图1所示。

图1 RA-Zn配合物的合成Figure 1 Synthesis of RA-Zn complex

2.2 SEM分析

通过SEM 观察到RA 结构比较松散，RA-Zn 则形成更大更均匀的晶体（图2）。

图2 RA和RA-Zn的SEM图像Figure 2 SEM images of RA and RA-Zn

2.3 红外光谱分析

RA 的红外吸收光谱中观察到羧酸的-OH 在3 514～3 160 cm-1内（图3），而在RA-Zn中减少，表明羧酸的羧基参与RA-Zn络合。在RA光谱中1 725 cm-1处代表羧基振动的谱带在RA-Zn 中消失，同样提示RA中羧酸结构参与金属螯合反应。

图3 RA和RA-Zn的红外光谱图Figure 3 Spectra of RA and RA-Zn detected by Fourier transform infrared spectosopy

2.4 紫外-可见光谱分析

为了研究RA-Zn 的组成，应用了摩尔比法。随着RA/Zn2+摩尔比的增加，282、326 nm 处的谱带强度增加，在374 nm 处又出现了新的谱带（图4），代表金属与酚的相互作用，表明邻苯二酚结构参与了金属离子配位。通过摩尔比法绘制在λ=374 nm 处的不同摩尔比RA/Zn的吸光度曲线。RA/Zn的比例接近2，证明两者的摩尔比为2。

图4 不同摩尔比RA/Zn的紫外-可见光谱Figure 4 UV-Vis spectra of RA/Zn with different molar ratios

2.5 细胞增殖活力分析

观察4种多酚作用第1天和第3天影响MC3T3-E1细胞增殖的情况，结果表明1×10-4mol/L 的RA 促进细胞增殖的作用最明显（图5A），优于其他3 种多酚（漆黄素、荭草苷、丹参酚酸B），作用第5 天RA-Zn促进细胞增殖的效果优于RA（P<0.05，图5B）。

图5 CCK-8法检测细胞增殖情况Figure 5 Cell proliferation detected by the CCK-8 assay

2.6 RA和RA-Zn的抗氧化活性分析

通过ABTS+的清除评估RA 和RA-Zn 的供氢能力，200 μmol/L RA-Zn 具有比RA更高的ABTS+阳离子自由基清除水平，约是RA 的2 倍（图6A）。通过RA和RA-Zn将Fe3+还原为Fe2+的能力评估其抗氧化性，200 μmol/L RA-Zn 具有比RA 更好的还原能力（图6B），差异有统计学意义。

图6 RA和RA-Zn的抗氧化活性测定Figure 6 Determination of antioxidant activity of RA and RA-Zn

2.7 比较RA和RA-Zn的MIC

图7 为MIC 法研究不同浓度的RA 和RA-Zn 对金黄色葡萄球菌的生长抑制情况。RA 浓度为25～200 μmol/L 时，细菌生长没有显著变化，RA≥400 μmol/L 时抑制细菌生长的作用，与对照组比较差异才有统计学意义（P<0.05，图7）。但RA-Zn≥25 μmol/L时，抑制细菌生长的作用与对照组比较差异就有统计学意义（P<0.05，图7），并有剂量依赖性，抗菌效果优于RA。

图7 MIC 法测定RA 和RA-Zn 对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用Figure 7 Determination of the growth inhibitory effects of RA and RA-Zn on Staphylococcus aureus using MIC method

酚类化合物的结构多种多样，从简单的酚酸（如阿魏酸、没食子酸和咖啡酸）到单宁和类黄酮等多酚。它们可通过酚的活性羟基转移氢原子来清除自由基，与促氧化金属螯合和引导酶失活或活化等途径发挥抗氧化作用，以对抗多种疾病，包括糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等［20］。多种多酚与金属络合后其性能增强，应用范围扩大。在骨组织工程中，许多类黄酮金属配合物在促进血管生成、增强成骨细胞分化和矿化方面具有巨大前景，如水飞蓟宾-Zn 配合物通过调节miR-590/Smad7 信号通路促进成骨细胞分化，同时表现出促血管生成和抗菌性［21］。槲皮素与铜络合后促进成骨细胞分化和血管生成［22］。

RA 作为天然的多酚化合物，已被证明可以通过RANKL/RANK/OPG 途径促进成骨细胞分化和矿化［23］，本研究中的细胞增殖实验结果表明其比漆黄素、荭草苷和丹参酚酸B 具有更好的促成骨细胞增殖作用，表明RA 具有在骨组织工程中应用的强大潜力。已有研究探索了RA与碱金属（锂、钠、钾）结合后的结构及抗氧化活性，结果表明配合物抗氧化性提高，其中与钠结合后抗氧化性最高［24］。选择合适的金属离子对提高生物活性非常重要，得益于Zn离子的抗氧化、促成骨和抗菌等作用，RA 与Zn2+络合后的生物活性得到进一步增强。红外和紫外光谱结果表明RA的邻苯二酚和羧基结构参与络合Zn离子，两者摩尔比值为2，也证实了RA-Zn的成功合成。两者结合发挥协同效应，RA-Zn 可进一步促进成骨细胞增殖，其ABTS+自由基清除活性约是RA的两倍，还原Fe3+的能力强于RA，因此RA-Zn 的抗氧化性增强，同时抑制金黄色葡萄球菌的能力也显著提升。过高浓度的Zn 离子将通过促进细胞内活性氧过量产生诱导细胞凋亡，不利于细胞黏附增殖，因此适当的Zn 离子对生物安全至关重要［25］。RA与Zn 的络合为引入Zn 离子提供了便利且有效的途径，可避免过高浓度Zn 离子的释放，生物安全性得到了保障。RA 和Zn 离子的络合是相互促进的正效应，但是，过量的RA-Zn 对机体可能会产生不利影响，需要严格把控使用浓度，这需要进一步的探索。

生物体内的过量自由基可能导致蛋白质、核酸、脂质等分子的损伤，从而破坏细胞稳态和促进凋亡，除了机体内产生内源性抗氧化分子抵抗氧化损伤，通过食物或外源性补充抗氧化剂是对抗氧化应激相关疾病（糖尿病、心脏病、高血压、癌症和退行性疾病等）的有益途径［26］。同时，由于目前抗生素的过度和不当使用，对新型抗菌剂的需求不断提升，而天然来源的抗菌剂被视为一种有前途的解决方案［27］。RA-Zn是新型抗氧化剂和抗菌剂的有力候选者，它对成骨细胞的促进增殖作用提示其可能在骨组织工程中有潜在应用价值，可将其添加到口腔种植体材料表面、生物支架、水凝胶等材料内以促进骨再生，这需要进一步研究。

综上所述，RA 和Zn 之间存在协同抗氧化和抗菌潜力，两者络合后产生了一种新的复合物，相比RA，复合物消除ABTS+自由基、还原Fe3+和抑制金黄色葡萄球菌的能力增强，同时表现出更强的促进成骨细胞增殖作用，配合物可以作为单个生物活性剂，或应用至各种生物材料中以增强抗氧化或抗菌能力，但仍需要未来进一步研究。

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