基于生物信息学技术和机器学习算法筛选急性心肌梗死核心基因

李淑娟，柯妍，刘旭东，贺茜，徐遥琴，田宇佳，卢冠军，马娟，朱澈，汪乐新，

作者单位：1.750004 宁夏回族自治区银川市，宁夏医科大学总医院急诊科 2.750003 宁夏回族自治区银川市第一人民医院全科医学科 3.750004 宁夏回族自治区银川市，宁夏医科大学总医院心胸外科 4.750004 宁夏回族自治区银川市，宁夏医科大学 5.750001 宁夏回族自治区银川市妇幼保健院儿科

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）指动脉内壁斑块导致流向心脏的血液减少甚至中断，进而使心肌细胞发生缺血缺氧性损伤［1］。但心肌细胞是永久性细胞，其损伤后一般不能再生［2］，故早期筛查AMI高风险人群具有重要的现实意义。近年来生物信息学技术在疾病诊断和预测方面应用广泛，而基因代谢组学作为生物信息学技术，其主要探究基因与疾病的关系［3-4］。目前，基于基因代谢组学探究肝癌、胃癌等核心基因的文献较多［5-6］，但应用该技术筛选AMI核心基因的报道较少。机器学习是基于数据构建的计算模型。本研究旨在通过生物信息学技术和机器学习算法筛选AMI核心基因并进行验证，现报道如下。

1.1 实验时间

本实验时间为2021—2022年。

1.2 采用生物信息学技术筛选差异表达基因

1.2.1 数据来源

从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的高通量基因表达（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载与AMI相关的3个mRNA基因芯片数据集（GSE34198、GSE66360和GSE83500），其中GSE66360〔非AMI患者20例（对照组），AMI患者17例（AMI组）〕和GSE83500〔健康对照者46例（对照组），AMI患者49例（AMI组）〕为测试集，GSE34198〔健康对照者46例（对照组），AMI患者49例（AMI组）〕为验证集。

1.2.2 筛选差异表达基因

运用R 4.2.0软件中的“limma包”，以|log2FC|＞1、P＜0.05为标准，筛选GSE66360和GSE83500中差异表达基因。

1.2.3 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析

应用差异表达基因数据软件对差异表达基因进行GO功能富集分析，分析其主要富集的生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）；
通过Metascape官网（https://metascape.org）对差异表达基因进行KEGG通路富集分析。

1.3 采用机器学习算法筛选核心基因

使用LASSO回归方法缩小差异表达基因的范围，然后使用支持向量机-递归特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）方法在差异表达基因中寻找特征基因，取两种机器学习算法的交集，即为核心基因。

1.4 核心基因表达水平及预测能力

比较测试集中AMI组和对照组核心基因表达水平，绘制ROC曲线以评估核心基因表达水平对测试集、验证集受试者发生AMI的预测价值，AUC为0.5～1.0，其值越大提示核心基因表达水平对AMI的预测价值越高。

1.5 细胞实验验证核心基因

1.5.1 实验细胞

大鼠心肌细胞株H9C2购自武汉普诺赛生物科技有限公司。

1.5.2 主要实验试剂与仪器

胎牛血清（Gibco，美国），DMEM 培养基（Gibco，美国），总RNA提取试剂盒（Axygen，美国），PrimeScript™ RT reagent Kit（Takara，日本），TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Takara，日本），IL1R2、NR4A2、TREM1引物〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕；
微量台式离心机（5810R）（Eppendorf，德国），荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）（德国耶拿分析仪器股份公司），厌氧培养袋及厌氧产气包（AnaeroPack-Anaero）（三菱公司，日本）。

1.5.3 细胞培养

采用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养心肌细胞，将其置于37 ℃、95% O2、5% CO2培养箱中培养，当细胞汇合度达80%左右时进行传代。

1.5.4 构建衰老心肌细胞模型及分组

采用D-半乳糖8 mg/ml刺激第2代心肌细胞9 d以制备衰老心肌细胞。将衰老心肌细胞按5×106个的数量接种到25T培养瓶中，然后随机将其分为正常氧组和缺氧/复氧组，其中正常氧组心肌细胞常规培养；
缺氧/复氧组心肌细胞缺氧3 h后复氧2 h，以制备AMI细胞模型。

1.5.5 qPCR法检测IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相对表达量

在25T培养瓶中收集正常氧组和缺氧/复氧组心肌细胞，按照总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，采用2-ΔΔCt法计算IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相对表达量。基因引物序列和产物长度见表1，扩增条件见表2。实验独立重复9次。

表1 基因引物序列和产物长度Table 1 Gene primer sequence and product length

表2 基因引物扩增条件Table 2 Gene primer amplification conditions

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行数据处理。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 差异表达基因筛选结果

从GSE66360和GSE83500中筛选出145个AMI差异表达基因，其中上调差异表达基因125个、下调差异表达基因20个，见图1。

图1 差异表达基因的火山图Figure 1 Volcano map of differentially expressed genes

2.2 GO功能富集分析结果

GO功能富集分析结果显示，差异表达基因主要涉及的BP为细菌的防御反应、中性粒细胞趋化性、粒细胞趋化性、中性粒细胞迁移、粒细胞迁移、骨髓白细胞迁移、白细胞趋化性、细胞对白介素1的反应、白介素1介导的信号通路；
主要涉及的CC为三级颗粒、特殊颗粒、分泌颗粒管腔、细胞质小泡腔、富含纤维胶凝蛋白1的颗粒膜、特殊颗粒管腔、三级颗粒膜、液泡管腔；
主要涉及的MF为碳水化合物的结合物、免疫受体活性、晚期糖基化终末产物受体结合物、IgG结合物、病毒颗粒结合物、细胞核糖皮质激素受体结合物、肽聚糖溶血活性、核视黄醇X受体结合物、低聚糖结合物、调理素结合物。

2.3 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要涉及的信号通路为天然免疫反应应答、吞噬细胞杀伤的正性调节的信号通路。

2.4 核心基因

在差异表达基因中，通过LASSO回归分析筛选出10个特征基因，见图2；
通过SVM-RFE方法筛选出10个特征基因，见图3；
取交集得到9个核心基因，分别为NFIL3、IL1R2、NR4A2、IRAK3、VCAN、CCL20、TREM1、LYZ、ITLN1，见图4。

图2 差异表达基因的LASSO回归分析结果Figure 2 LASSO regression analysis results of differentially expressed genes

图3 差异表达基因的SVM-RFE方法分析结果Figure 3 SVM-RFE method analysis results of differentially expressed genes

图4 差异表达基因的韦恩图Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes

2.5 AMI核心基因表达水平及其预测价值

在测试集中，AMI组仅IL1R2、NR4A2、TREM1表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。ROC曲线分析结果显示，IL1R2、NR4A2、TREM1 表达水平预测测试集受试者发生A M I 的AUC分别为0.648〔95%CI（0.534～0.756）〕、0.623〔95%CI（0.511～0.728）〕、0.622〔95%CI（0.502～0.730）〕，见图6；
IL1R2、NR4A2、TREM1 表达水平预测验证集受试者发生A M I 的AUC分别为0.834〔95%CI（0.761～0.898）〕、0.866〔95%CI（0.802～0.923）〕、0.808〔95%CI（0.729～0.880）〕，见图7。

图5 测试集中对照组与AMI组IL1R2、NR4A2、TREM1表达水平比较的箱式图Figure 5 Box plot of comparison of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels between the control group and the AMI group

图6 IL1R2、NR4A2、TREM1表达水平预测测试集受试者发生AMI的ROC曲线Figure 6 ROC curve of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels in predicting AMI in subjects in test set

图7 IL1R2、NR4A2、TREM1表达水平预测验证集受试者发生AMI的ROC曲线Figure 7 ROC curve of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels in predicting AMI in subjects in validation set

2.6 qRT-PCR法验证核心基因mRNA相对表达量

缺氧/复氧组心肌细胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相对表达量高于正常氧组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 正常氧组与缺氧/复氧组心肌细胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相对表达量比较（±s，n=9）Table 3 Comparison of relative expression levels of IL1R2，NR4A2 and TREM1 mRNA between normal oxygen group and hypoxia/reoxygenation group

表3 正常氧组与缺氧/复氧组心肌细胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相对表达量比较（±s，n=9）Table 3 Comparison of relative expression levels of IL1R2，NR4A2 and TREM1 mRNA between normal oxygen group and hypoxia/reoxygenation group

组别IL1R2NR4A2TREM1正常氧组0.187±0.0430.127±0.0440.424±0.279缺氧/复氧组0.245±0.0290.257±0.0292.784±2.639 t值3.3157.3742.668 P值0.004＜0.0010.028

AMI发病迅速且具有较高的死亡率［7-8］。目前，冠状动脉造影是诊断AMI的“金标准”，但其属于有创检查，故寻找AMI非创伤性诊断方法具有临床价值。本研究通过生物信息学技术和机器学习算法筛选出9个AMI核心基因，且在测试集中，AMI组仅IL1R2、NR4A2、TREM1表达水平高于对照组；
ROC曲线分析结果显示，IL1R2、NR4A2、TREM1表达水平预测测试集受试者发生AMI的AUC分别为0.648、0.623、0.622，三者预测验证集受试者发生AMI的AUC分别为0.834、0.866、0.808；
且缺氧/复氧组心肌细胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相对表达量高于正常氧组，提示IL1R2、NR4A2、TREM1是AMI核心基因。

RONG 等［9］研究表明，IL1R2 基因多态性（rs11674595、rs4851527、rs2072472和rs3218977）可能与中国汉族人群骨质疏松症的发病有关，但其在AMI中的作用有待深入挖掘。NR4A2属于核受体4A亚家族，其编码类固醇甲状腺激素类维生素A受体，是核受体转录因子，而核受体转录因子在哺乳动物神经元发育、炎症、记忆形成等方面具有调节作用。研究表明，NR4A2基因突变与癫痫发作、神经发育异常和机体发育异常有关［10-13］。KARKI等［14］研究表明，NR4A2在胶质母细胞瘤中是促癌基因，且其在心血管应激反应中具有重要作用。ASHRAF等［15］研究表明，在成年哺乳动物心脏，特别是在心肌细胞中，在β-肾上腺素能刺激下NR4A2表达明显上调，其特异性过表达导致终末分化的心肌细胞重新进入细胞周期和DNA复制增加，但不导致心肌细胞分裂。TREM1是髓样细胞触发性受体家族成员，属于免疫球蛋白超家族受体，其主要功能是识别外源性抗原和毒性物质，从而调节炎症反应［16］。LIU等［17］研究表明，TREM1放大了脑源性和肠源性免疫原性成分的促炎反应，在TREM1上表达的触发受体可在多种心血管疾病中驱动炎症反应。VANDESTIENNE等［18］研究表明，TREM1可参与腹主动脉瘤的病理生理过程。KIMMOUN等［19］研究表明，TREM1与心源性休克患者90 d死亡率和各种器官损伤有关，但其在AMI中的具体分子机制尚不清楚。

综上所述，IL1R2、NR4A2、TREM1是AMI核心基因，三者有望成为AMI潜在的生物标志物。但本研究仍存在一定局限性：（1）无法阐明IL1R、NR4A2、TREM1导致AMI的具体机制；
（2）无法明确IL1R、NR4A2、TREM1是否与其他组学有关，如代谢组学、蛋白组学等。

作者贡献：李淑娟进行文章的构思与设计，负责撰写、修订论文；
柯妍进行研究的实施与可行性分析；
刘旭东、贺茜、徐遥琴进行数据收集、整理、分析；
田宇佳、卢冠军、马娟、朱澈进行结果分析与解释；
汪乐新负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。

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