闭玉娟 覃贝芬 黄钰珉 谭艳梅(通讯作者)
(南宁市第五人民医院,广西 南宁 530021)
精神分裂症(SCZ)是一种慢性持续性的重性精神疾病,病因复杂,患病率、致残率、复发率、死亡率均较高[1]。近年来,越来越多的研究表明,精神分裂症与炎性因子有一定的相关性,如白细胞介素2、白细胞介素4[2]、白细胞介素6[3]、血管内皮生长因子等。本研究探讨血清TNF-α 浓度、TNF-α rs1799724 及rs1799964 两个位点的核苷酸多态性与精神分裂症的相关性,为精神分裂症易感人群的筛选提供依据。
1.1 一般资料 选取我院2021 年3 月至2022 年7 月确诊为精神分裂症患者120 例(男55 例、女65 例),患者年龄20~45 岁,平均(32.58±5.34)岁。另选取我院体检中心健康体检者为对照组120 例(男53 例、女67 例),患者年龄20~47 岁,平均(32.69±5.58)岁。
1.2 方法
1.2.1 样本采集与保存 各病例组及对照组研究对象均采早空腹静脉血5 mL,其中2 mL 置于EDTA-K2抗凝管内,颠倒8 次充分混匀,置于-20 ℃冰箱保存用于提取DNA;
3 mL 置于干燥管内,待标本凝固后经3500 转/min 离心5 min,取血清1500 uL 置于1.5 mL 离心管内,置于-20 ℃冰箱保存用于检测血清TNF-α 浓度,所有标本均避免反复冻融。
1.2.2 实验方法 TNF-α rs1799724(-857 C/T)及rs1799964(-1031 T/C)位点分型检测:使用Biospin全血基因组DNA 提取试剂盒提取全血基因组DNA,在超微量紫外分光光度测定样本DNA 浓度、OD260、OD280 和OD260/OD280 的值,取浓度>20 ng/uL,OD260/OD280 为1.8~2.0 为合格DNA 样本。使用qPCR 法检测TNF-α rs1799724 及rs1799964 基因型及等位基因。实验设阳性对照及阴性对照保证实验的可靠性。经测序验证并用Gene Marker 分析、判断位点信息。
1.2.3 血清TNF-α 浓度测定 用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定,原理如下:通过将纯化的人TNF-α 抗体包被在微孔板上制成固相抗体,在各孔依次加入标本或标准品、生物素化的抗TNF-α 抗体及辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-avidin),使之在微孔板内形成固相抗体-TNF-α-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 的催化下变为蓝色,并在终止液的作用下变为黄色。黄色的深浅和血清样本TNF-α 浓度呈正相关,用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD 值),用曲线专家绘出标准曲线,通过标准由线计算各血清样本TNF-α 浓度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0 软件处理,计量资料用()表示,用t检验;
计数资料用(%)表示,用χ2检验,P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 研究对象基本情况 对照组年龄(32.69±5.58)岁,精神分裂症组年龄(32.58±5.34)岁。哈维平衡结果:在rs1799964 位点上精神分裂症组χ2=1.982;
P=0.159;
对照组χ2=1.126;
P=0.289;
在rs1799724 位点上精神分裂症组χ2=0.197;
P=0.657;
对照组χ2=2.094;
P=0.148。
2.2 两组TNF-α 浓度比较 两组TNF-α 浓度对比无差异。精神分裂症组rs1799724 不同基因型TNF-α浓度存在显著性差异,见表1。
表1 精神分裂症组TNF-α 两个位点不同基因型TNF-α 浓度比较
2.3 rs1799724 基因型及等位基因频率分布及风险评估 经logistic 回归分析,rs1799724 基因型OR=0.653;
P=0.493,等位基因OR=0.714;
P=0.439;
rs1799964 基因OR=0.761;
P=0.660,等位基因OR=0.736;
P=0.483,无显著差异(P>0.05),见表2。
表2 rs1799724 基因型与rs1799764 基因型及等位基因在两组频率分布及风险评估
实验结果未发现rs1799964 基因型与TNF-α 表达有相关性,发现rs1799724 位点不同基因型TNF-α浓度存在显著性差异,携带突变基因的基因型即CT、TT 基因型对应的TNF-α 高于CC 基因型对应的TNF-α 浓度[4]。蛋白表达浓度是复杂的,除了受相关基因多态性影响外,还受体内多种因子影响,同时也受蛋白合成原料及合成环境影响,并且rs1799964、rs1799724 两个位点同为启动子区域内的位点,在TNF-α 蛋白的表达里起多少作用是不能与TNF-α基因启动子完全分割的。
有研究表明,在总体患者或单独女性患者,位点rs1799964 位点基因多态性与精神分裂症的发病呈现一定的相关性。作为被认为与TNF-α 表达相关的位点,rs1799964、rs1799724 与精神分裂症的关系不仅受到国内科研人员的注意,国外对两者的关系也有报道,Suchanek-Raif[5]也报道了TNF-α rs1799964、rs1799724在男性中显示出的突变基因型与精神分裂症有相关性。本研究中,既没有发现rs1799964 与TNF-α 蛋白表达的关系,也没发现与精神分裂症发病相关,造成这种各研究之间不同结论的原因可能与各自的实验设计有关。
综上所述,血清TNF-α 表达与rs1799724 位点基因型有关与rs1799964 位点基因型无关,两个位点不是精神分裂症的易感基因。
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