非梗阻性无精子症的遗传学病因及治疗研究进展

谢金龙

(潍坊市人民医院生殖医学中心,山东潍坊 261000)

不孕不育症严重影响着人类的生殖健康[1],发病率高达15%～20%,其中男性因素占到50%[2]。无精子症是男性不育的严重类型,分为梗阻性无精子症(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性无精子症(nonobstructive azoospermia,NOA)2大类,其中OA约占40%、NOA约占60%。NOA主要是由精子发生或者成熟障碍引起,其病因复杂,包括隐睾、腮腺炎引起的睾丸炎后遗症等继发性睾丸损伤、Klinefelter综合征、Y染色体微缺失、基因突变等。目前缺乏使患者恢复生精功能的治疗策略,有研究行术前激素治疗[3]、改善睾丸生精微环境[4]、干细胞疗法[5]等策略,希望找到精子结合卵胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)获得遗传学子代。本文就非梗阻性无精子症的遗传学病因及治疗研究进展予以综述。

1.1 NOA与基因突变NOA常与基因突变有关,目前有超过2 000个基因已被证明与人类精子发生有关[6]。拷贝数变异(copy number variation,CNV)和单核苷酸多态性也是男性不育的危险因素,但是很少有研究提供功能和生物学证据来验证这些变异为致病基因[7]。越来越多的证据表明,TEX11和TEX15在NOA不育男性中发生突变,导致减数分裂停止[8-9]。WU[10]、YANG等[11]报道TDRD9、FOXP3导致精原干细胞的凋亡,TEX11、SYCE1、PAK1、ADGRG2、TEX14、KASH5导致减数分裂阻滞,SOHLH1、ZMYND15、DMC1、PABPC1、WT1、CFAP65、RNF212等导致NOA。

1.2 NOA与DNA甲基化MCSWIGGIN等[12]研究表明DNA甲基化异常可能导致男性不育。雄性生殖细胞的DNA甲基化从有丝分裂和减数分裂的生殖细胞开始,减数分裂粗线期阶段完成[13]。精子中异常的DNA甲基化可能导致男性不育并将其遗传给后代,而后代在以后的生活中可能更容易患上疾病。吸烟对DNA甲基化也有很大的影响,它通过改变MAPK8IP和TKR基因区域的CpG甲基化模式,导致精子数量减少、活力下降和精子形态缺陷[14]。生殖相关基因Nme2、Trim27、ICR、H19、SNRPN、Sort和Pebp1的低甲基化对小鼠精子发生和精子活力产生了负面影响[15]。SOX30启动子处的DNA高甲基化有助于其在NOA中的表达沉默,SOX30水平的降低与NOA疾病的严重程度有关。SOX30在小鼠体内的缺失会损害生精细胞和阻滞精子发生,导致雄性不育,但是SOX30不影响卵巢发育和女性生育能力[16]。

1.3 NOA与染色体异常和Y染色体微缺失

1.3.1染色体异常 遗传疾病是无精子症的主要原因之一,包括染色体异常、单基因疾病、多基因疾病、表观遗传疾病等[17]。Klinefelter综合征是NOA中最常见的染色体异常疾病,而少精子症在常染色体结构缺陷男性中更为常见[18]。Klinefelter综合征是导致不育症的主要原因之一,典型表现为小睾丸、性腺功能减退和认知障碍。Klinefelter综合征与心血管异常、自身免疫性疾病、代谢紊乱、认知或精神健康问题相关,也可能增加死亡风险[19]。

2.1 激素优化治疗内源性睾酮(intratesticular testosterone,ITT)水平低下、睾酮与雌二醇比例异常可能与NOA的病理生理学有关[25],因此以改善精子发生的激素生精微环境为目的的治疗可能有益。王澍弘等[26]报道38例NOA患者应用来曲唑治疗后有1例患者精液中发现了精子,37例患者的Johnsen评分较前改善。LAURSEN等[27]报道了8例NOA患者,给予每周2次人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)治疗,结果提示促性腺激素治疗后改善了生精功能,4例患者睾丸中找到了精子。在一项非随机多中心研究中,442例男性NOA患者接受了取精手术,激素优化治疗组的精子获取率(57%)优于未行激素优化治疗组(34%)[28]。尽管文献表明激素优化治疗可能对NOA患者有益,但现有证据的数量和质量不足以推荐激素优化治疗作为标准临床治疗方案。

睾酮是精子发生过程中的必需激素,它通过对miRNA的调节有助于维持支持细胞和生殖细胞的紧密连接。睾酮的缺失会导致血睾屏障的破坏,发育中的精子生殖细胞从支持细胞过早脱离,并阻止成熟精子从支持细胞释放以及生殖细胞被吞噬[29]。血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和睾酮都是促进精子完全发生所必需并且两种激素对精子发生有协同作用,FSH调节睾丸功能并刺激支持细胞产生雄激素结合球蛋白,这有助于维持较高的ITT浓度[30]。

2.1.1血清激素水平与精子获取的关系 LI等[31]研究表明术前FSH水平并不能良好预测NOA患者显微取精手术获精率。在行显微取精的患者中,血清FSH水平较高(>15 mU/mL)和FSH水平较低的NOA患者有更高的获精率。NOA患者中,基础血清FSH水平与精子发生和精子获取率无关[32],因此其预测NOA患者对激素治疗的反应性欠佳。CAROPPO等[3]通过研究进行分析,指出睾酮水平正常比睾酮水平低下的克氏征患者有更高的精子获取率。同样国内安庚教授团队[33]一项回顾性队列研究分析,针对395例NOA患者给予显微取精术前HCG/HCG加高纯度尿FSH治疗3个月,结果显示术前促性腺激素治疗组和非促性腺激素治疗组获精率的差异具有统计学意义(31.2%vs.19.5%),使用倾向性评分加权-逆处理概率加权法(inverse probability of treatment weighting,IPTW)进行多变量逻辑回归模型分析显示术前促性腺激素治疗与获精率之间存在相关性(OR1.59;95%CI：1.02～2.52;P=0.042)。因此,血清FSH水平高或非常高不应阻止使用外源性FSH刺激精子发生。

2.1.2睾丸显微取精术(microdissection testicular sperm extraction,MD-TESE)术前接受激素治疗 研究发现外源性促性腺激素对恢复无精子症伴促性腺功能减退的男性的精子发生有效。尽管部分NOA患者存在较高的FSH和LH水平,依然术前进行激素治疗来改善精子发生的睾丸微环境,使得Leydig细胞对高剂量HCG刺激产生的睾酮产生反应[34]。同时由于睾酮和抑制素B对下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈减弱导致促性腺激素脉冲频率和幅度的改变来保持激素应答,因而可以使用外源性促性腺激素或选择性雌激素受体调节剂来改变内源性促性腺激素分泌改善生精环境,促进精子生成。有研究表明,与单纯HCG刺激相比,FSH加HCG刺激支持细胞雄激素受体(androgen receptor,AR)表达增加[35]。在REIFSNYDER等[36]的研究中,接受激素治疗(n=307)和不接受激素治疗(n=41)的睾酮水平低下的NOA患者获精率没有差异;而在HUSSEIN等[28]的研究中,接受激素治疗的男性的获精率(61.7%,306/496)明显高于未接受激素治疗的男性(33.6%,39/116),10.9%(54/496)的患者在治疗后精液中发现了精子。

现有研究的结果虽然表明有希望改善NOA患者获精率,但不足以推荐每个NOA患者行激素治疗[37]。正如美国泌尿外科学会(American Association of Urology,AUA)/美国生殖医学会(American Society of Reproductive Medicine,ASRM)关于男性不育的诊断和管理指南,NOA患者应该在手术干预前被告知有限的药理学的数据[38-39]。

2.1.3激素优化治疗未来需求及方向 NOA患者的管理在很大程度上是基于循证医学证据。由于过去20年的文献提供的证据,大约50%的NOA患者可能成功地获得他们的睾丸精子,与其他可用的手术技术相比,显微取精在获精率方面提供了更好的结果[40]。对睾酮水平正常与低下患者的获精率的研究表明,在显微取精治疗前,睾酮水平低下的NOA患者行激素优化治疗,可能改善获精率。ITT在睾丸内的浓度比血液循环中的浓度高100～1 000倍,但目前在人和动物身上维持精子发生的合适ITT浓度尚不明确。为了提高我们在这一领域的知识,识别能够可靠预测ITT水平并用于治疗后ITT水平监测的血清生物标志物可能会有所帮助。因此,血清17-OHP和INSL3水平在一定程度上与ITT水平相关,这可能为新的研究方向提供思路。

在NOA患者中,FSH对于促进精原细胞增殖至关重要[41]。尽管许多研究都对FSH治疗男性少精子症的可行性进行了研究,但是很少有研究试图评估单独使用FSH提高NOA患者获精率的效果。事实上,FSH可能独立于睾酮维持精子产生,这一发现在激活FSHR突变的转基因雄性小鼠中发现,这可能促使进一步研究高剂量FSH治疗男性NOA。

激素治疗是否有助于提高NOA患者的生殖潜能,研究时设计大样本量、严格的入组标准和评价指标至关重要。目前证据不足以支持NOA患者术前不加选择地使用激素治疗。

2.2 生精微环境改善治疗NOA深入研究生理状态下生精微环境的建立和成熟过程,是理解NOA患者发病原因和病程的重要理论基础。ZHAO等[42]发现支持细胞的成熟是生精微环境功能形成过程中的关键事件。未成熟的支持细胞处于以氧化磷酸化为主的活跃代谢状态,成熟的支持细胞主要通过糖酵解途径进行低水平的能量代谢。该团队以正常发育图谱作为标尺,通过对比3类最常见的NOA(克氏综合征、Y染色体微缺失和特发性NOA)睾丸组织单细胞测序结果,发现特发性NOA支持细胞表现为发育过程的谱系退化;而同样缺乏生殖细胞的Y染色体微缺失和克氏综合征患者,其支持细胞表现为细胞凋亡、异常免疫反应和激素代谢紊乱等病理性变化。该团队分析发现Wnt/β-catenin信号通路的激活是幼稚型支持细胞和特发性NOA支持细胞共有的典型特征,提示其在调控支持细胞成熟中的重要作用。虽然Wnt/β-catenin通路在所有患者中都被激活,但Wnt/βcatenin通路的负调控因子HOPX在Stage_a支持细胞中不表达,而在Stage_c细胞中高表达。HOPX被认为是通过抑制Wnt信号通路来促进干细胞成熟的。通过抑制Wnt信号的抑制剂处理细胞,成功地促进了支持细胞的部分成熟,其可以维持精原性干细胞的增殖,提示其支持、营养生殖细胞功能的改善[43]。

在NOA患者中,支持细胞具有明显不成熟和异质性。生殖细胞本身也会影响微环境中的细胞,恢复成熟的微环境可能激活局部的生精灶。

2.3 干细胞治疗NOA干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞。根据来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)及成体干细胞(adult stem cells,ASCs)。ESCs指早期胚胎中的全能干细胞,ASCs指组织中可定向分化为特异组织的干细胞,如精原干细胞(spermatogonia stem cells,SSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 等。

ZHOU等[44]报道了来自小鼠ESCs在体外诱导成原始生殖细胞样细胞(primordial germ cell like cells,PGCLCs),PGCLCs与KITW/KITW-V小鼠出生早期睾丸细胞共培养,实现了体外完整的减数分裂产生,获得单倍体精子样细胞,ICSI后产生可育的后代。人成纤维细胞来源的重编程hiPS在BMP4、BMP8等细胞因子诱导下可以形成PGCLCs、减数分裂前的生殖细胞、减数分裂细胞、单倍体配子样细胞,但尚未能形成成熟精子并产生胚胎。但伦理问题、成瘤性及免疫排斥反应制约了ESCs 的临床应用。

人SSCs和支持细胞在体外共培养产生圆形精子,注射到人卵子可受精并形成囊胚,但胚胎并不能够达到桑葚胚阶段,且伴有染色体异常。目前,人SSCs体外增殖培养虽然已经实现,但是培养难度大,长期培养SSCs会发生表型改变,且尚未实现人SSCs 体外诱导分化形成精子,距离临床应用也有距离[45]。SLCs是一类睾丸间质细胞,可分泌睾酮影响睾丸微环境,可增殖并定向分化为间质细胞。ZANG等[46]通过移植CD51+、Nestin+的SLCs能够使小鼠雄激素水平升高,通过调节睾丸生精微环境改善生精功能,恢复生育力。

随着arrays-CGH、GWAS、WGS、NGS等新型高通量方法的快速发展,越来越多的潜在致病基因和与不育症相关的新基因被发现,为明确NOA的遗传学病因提供了参考依据,从而为寻求NOA治疗靶点提供研究思路。NOA患者虽然经过激素治疗、干细胞疗法、改善生精微环境、睾丸显微取精等手段,约50%患者可以获取到精子通过ICSI获取子代,满足患者的生育需求,但是仍有很大比例的NOA患者无法获得精子,只能通过供精来生育子代,带来了许多伦理与社会问题。因此未来仍需要通过大样本、高质量的研究来评估改善生精功能,明确预测指标、如何提高获精率将是下一步工作的重点。

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