基于网络药理学研究紫龙金片治疗口咽癌的作用机制

曾 鹏,王绍川,杨子怡,朱培亮,蔡佳宜,邓雪儿,齐宝平

1.肇庆学院食品与制药工程学院(广东 肇庆 526000) 2.湖北民族大学化学与环境工程学院(湖北 恩施 445000)

口咽癌是世界上常见的第6大癌症,每年新增患者超过30万,并出现逐年上升的趋势[1]。口咽癌的生长较快,具有较大的破坏性,其癌细胞的转移是严重的并发症之一,严重危及患者生命。口咽癌主要由化学因素、感染因素、遗传因素、环境因素等导致,大量研究表明口腔癌可能与人乳头瘤病毒(HPV)息息相关。其作用机制主要通过E6和E7基因的异常表达。E6基因的表达水平异常会影响细胞生长调节的功能,而E7基因的异常表达会通过E2F活性因子间接导致机体细胞癌变[2]。目前,对于口咽癌的治疗方法仍以手术和放疗为主,对其疾病的发生和分子作用机制仍不明确,缺乏深入的分子生物学研究。

紫龙金片的主要成分为半枝莲,丹参,当归,黄芪,龙葵,郁金,蛇莓和白英,具有益气养血,清热解毒,理气化瘀等功效,在临床上常用于治疗气血两虚证、原发性肺癌化疗的患者。在中医理论的指导下,基于中药成分的多样性、分子网络的复杂性等特点,在癌症的临床治疗中有成效[3-5]。因此,本研究通过网络药理学方法探讨紫龙金片治疗口咽癌的可行性,并通过分析该药物与疾病的活性成分与靶点的关联性得出其治疗机制。

1.1紫龙金片的活性成分及靶点的预测紫龙金片含8种主要成分,分别为半枝莲,丹参,当归,黄芪,龙葵,郁金,蛇莓和白英。在YaTCM数据库(http://cadd.pharmacy.nankai.edu.cn/yatcm/home)与TCMSP数据库(http://tcmspw.com/index.php)中检索上述药物的活性成分,并根据口服生物利用度[6](OB)≥0.3、类药性[7](DL)≥0.18对活性成分进行筛选。将筛选结果导入string数据库(https://cn.string-db.org/)[8]中进行蛋白质的基因名称标准化。

1.2检索口咽癌的相关靶点在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中将物种设置为“Homo sapiens”,把“oropharyngeal cancer”作为关键词,检索其相关靶点,并将相关靶点导入至excel表中。

1.3筛选共有靶点及紫龙金片的关键成分将药物靶点与疾病靶点输入至微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)中获取共有靶点。使用Cytoscape 3.8.0[9]软件建立“中药-活性成分-靶点”网络,以显示共有靶点与紫龙金片作用在这些靶点上的活性成分之间的关系。分析所得活性成分与靶点的度值,筛选出紫龙金片治疗口咽癌的主要活性成分与靶点。

1.4构建共有靶点的蛋白质PPI网络在String数据库中,物种设置为“Homo spaiens”,输入1.3中筛选出的共有靶点,生成蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,在Cytoscape 3.8.0软件中进行PPI网络的可视化,导出数据文件,通过度值进行排序,对核心靶点进行筛选。

1.5共有靶点的基因功能富集分析在David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行GO分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,GO分析由生物工程(biological process,BP)、细胞成分(cellular componen,CC)、分子功能(molecular function,MF) 3部分组成。导入药物与疾病的共有靶点,设置P<0.01筛选出前10个GO条目(包含BP、CC、MF)和前20条KEGG通路,利用微生信网站制作气泡图和“KEGG通路—共有靶点”网络图,以此对其进行分析[10]。

1.6核心靶点与关键成分的分子对接将核心靶点导入RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)[11]中查看其蛋白质3D结构并导出为PDB格式,将其导入SYBYL-X 2.1.1中转化为mol 2格式文件。然后在SYBYL-X 2.1.1中用核心靶点和关键活性成分的分子开展对接,分子对接结合的分值越高,意味着结合的越稳定效果越好。

2.1紫龙金片的活性成分及靶点的预测在TCMSP数据库中,最终检索到紫龙金片的8个中药中含有783个成分,包括半枝莲94个,丹参202个,当归125个,黄芪87个,龙葵39个,郁金222个,蛇莓8个,白英6个。以OB≥0.3,DL≥0.18为筛选条件,结果得到145个活性成分,2329个靶蛋白。

2.2口咽癌相关靶点将“oropharyngeal cancer”作为关键词录入至GeneCards数据库中,得到1836个靶点基因,以“relevance score”为依据,最后筛选出505个靶点基因。

2.3紫龙金片的关键成分及共有靶点采用Venny 2.1对二者相关靶点进行绘制(图1),得到共有靶点106个。根据所得的数据导入Cytoscape 3.8.0,得到“中药-活性成分-靶点”网络,见图2。

图1 紫龙金片和口咽癌的共同靶点韦恩图

图2 “中药-活性成分-靶点”网络图

2.4共有靶点的蛋白质PPI网络构建在String数据库中导入共有靶点,将得到的数据导出至Cytoscape 3.8.0软件可以获得共同靶点的蛋白质PPI网络(图3)。TP53,AKT1,ALB,CASP3,ESR1,MYC为前5位的核心靶点,ESR1与MYC度值一致并列选入。因此这6个核心靶点高度参与了紫龙金片辅助治疗口咽癌的过程。

图3 共同靶点的PPI网络

2.5共有靶点的基因功能富集分析对106个共同靶点进行GO和KEGG的富集分析(图4),生物学过程(BP)主要与分泌调控有关,细胞组成(CC)主要与溶酶体(lysosome)、内质网腔(endoplasmic reticulum lumen)、囊泡的运输等有关,分子功能(MF)主要与信号受体调节活性 (signaling receptor regulator activity)、阳离子的通道活性(cation channel activity)、NF-kappaB结合(NF-kappaB binding)等有关。KEGG富集分析得到的结果如图5所示,其主要富集于neuroactive ligand-receptor interaction、cAMP、Serotonergic synapse、cGMP-PKG等信号通路。前20个KEGG通路在106个共同靶点中对35个靶点发生作用(图6)。表明紫龙金片能够通过多条通路与多个靶点协同下对口咽癌起治疗作用。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG功能富集分析

图6 “KEGG路径-共同目标”网络图

2.6核心靶点与关键成分的分子对接取3个核心靶点AKT1,TP53与ALB与5种关键成分槲皮素、丹参酮IIA、鼠尾草酚酮、木犀草素、甾醇进行15组分子对接实验。结果按照自由结合能大小均<0,说明关键成分与核心靶点之间能够自由结合。其中结合效果排名前3的分别为AKT1-槲皮素(-4.8kcal/mol),ALB-木犀草素(-5.7kcal/mol),TP53-槲皮素(-6.0kcal/mol)。其中槲皮素与3个核心靶点的结合能力的分数平均值均<-5kcal/mol,说明对接结果良好(图7)。因此说明槲皮素等关键成分起到了治疗口咽癌的关键作用。

a:AKT1和槲皮素的三维结构图和二维结构图;b:ALB和木犀草素的三维结构图和二维结构图。

紫龙金片主要的功效是清热解毒、益气养血,因此气血两虚的原发性肺癌化疗的患者会使用紫龙金片作为药物进行治疗,紫龙金片也可应用在其他癌症的辅助治疗。本实验通过在网络药理学的基础上分析了紫龙金片145个活性成分和得到271个靶基因,通过分析Venn图中交集部分的106个共有靶点和“中药-活性成分-靶点”图,以“degree”值的大小为依据分析推算槲皮素,丹参酮IIA,鼠尾草酚酮,木犀草素,甾醇等5个成分为重要的成分和AKT1,TP53,ALB等为关键靶点。其中,槲皮素具有多种药理作用,例如抗炎、抗菌、抗氧化、抗纤维化和清除自由基等[12-13]。文献研究显示[14]通过2种方式来抑制癌细胞的增长,分别是诱导凋亡和抑制迁移。近来研究阐明丹参酮IIA具有抗氧化,抗肿瘤及对阿尔茨海默病的治疗等作用[15]的类似物还具有抗菌抗炎作用与具有众多的药理活性。木犀草素(Luteohn)不仅能够诱导细胞自我降解和循环利用胞内组分的过程、抑制肿瘤细胞增殖,还能够形成抗肿瘤的作用,通过在多途径、靶点、多环节的过程。

在分析共同靶点的蛋白质PPI网络后能够得出结论,根据靶点的度值可以选取出TP53,AKT1,ALB,CASP3,ESR1,MYC为前度值排名前5的6个核心靶点,其中ESR1和MYC的度值相同。TP53基因编码一种包含转录激活、DNA结合和寡聚结构域的抑癌蛋白。编码蛋白对许多种细胞具有通过应激反应和控制靶基因的表达从而诱导细胞分裂异常、还有DNA修复或代谢改变[16]。AKT1是一种蛋白激酶,参与了乳腺癌、前列腺癌等多种癌症的发生、发展、转移和复发的多个环节[17]。

结合GO生物过程分析和KEGG富集分析的结果,这些通路包括:PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路等通路。其中,对PI3K-Akt信号通路的分析,其中共有35个靶点直接与此通路作用。通路的富集结果除了以上肿瘤相关信号通路,前列腺癌和胰腺癌等具体癌症类型也有具体通路,还有其他病毒感染相关的信号通路,说明这些疾病与肿瘤的通路可能是共通的,要留意在抗肿瘤的同时副作用的产生。最后在分子对接的基础上,大部分关键成分和核心靶点的对接结果较理想,因此认为关键成分和核心靶点间存在紧密的联系。

综上所述,紫龙金片主要通过槲皮素、木犀草素,甾醇等主要活性成分作用于TP53,AKT1,ALB,CASP3,ESR1,MYC等靶点,其中对TP53,AKT1和ALB的作用较为明显,参与病毒等相关通路和细胞调节的过程,最终达到抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡,进而达到辅助治疗口咽癌的作用,为以后临床试验提供了可能性。

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