高效液相色谱法测定山楂果中熊果酸和齐墩果酸

何凤云,崔蓓蓓,邵大志,张长丽

(南京晓庄学院 环境科学学院,江苏 南京 211171)

山楂为药食两用品种,在临床应用广泛,具有消食健胃,行气散瘀,化浊降脂之功效,常用于肉食积滞,胃脘胀满,瘀血经闭等症。熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)是山楂中重要的活性成分。UA具有抗肿瘤、对肝损伤有保护、抗病毒抗菌作用[1]。OA具有广谱抗菌药物的特性,在临床上常被用于护肝、降酶、治疗急性肝炎等方面[2],因此测定山楂中UA和OA的含量,对于评价山楂质量具有重要意义。

图1 熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)的结构式

UA和OA均为五环三萜酸类物质,如图1所示,两者为同分异构体,结构极为相似,不同之处仅仅是E环上的一个甲基的位置不同,因此同时测定UA和OA的难度大。目前同时测定UA和OA的方法有薄层色谱法[3]、气相色谱法[4]、毛细管电泳法[5]、液相色谱法[6]。薄层色谱法操作较为繁琐,气相色谱法需要衍生化,毛细管电泳仪应用面较窄,液相色谱法应用最广泛[7]。测定山楂及相关制剂中UA和OA多采用常规C18柱[8-17],分离时间在16～30 min之间;采用的流动相有甲醇-水[8-10]、甲醇-乙酸铵水溶液[11]或甲醇-磷酸水溶液[12,13]或甲醇-乙腈-乙酸铵水溶液[14,15]、甲醇-磷酸-三乙胺水溶液体系[16,17]。这些方法存在峰形和分离度不太理想或流动相组成复杂或出峰时间长等问题。缓冲盐的加入会增加色谱柱平衡时间,三乙胺加入提高了分离效果但会严重影响色谱柱寿命。国内未见使用甲醇-甲酸水溶液分离UA和OA的报道。

本研究采用对C18柱友好的甲醇-甲酸水溶液体系,建立了同时测定山楂中熊果酸和齐墩果酸的液相色谱法,齐墩果酸和熊果酸在13 min内实现了基线分离,为山楂的质量控制提供依据。

1.1 试剂

甲醇(色谱纯),娃哈哈纯净水,熊果酸(分析标准品,纯度>98.5%,aladdin),齐墩果酸(分析标准品,纯度>98%,aladdin),其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1260 Infinity II,配备DAD检测器),紫外可见分光光度计(岛津UV-2450),超声波清洗仪(KQ3200DB, 昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 色谱条件

色谱柱: Aupos Classical C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相:甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10);流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长210 nm;进样量10 μL。

1.4 实验方法

1.4.1 流动相的配制

甲醇超声波处理20 min得到流动相A;移取甲酸220 μL,加入到1 L纯净水中,得到pH=3.0的甲酸水溶液,并超声波处理20 min,得到流动相B。优化流动相组成,最终确定流动相组成为90% A-10% B(V/V)。

1.4.2 混合标准溶液的配制

精确称取10 mg的熊果酸(UA)和5 mg的齐墩果酸(OA)于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容得到储备标准溶液。用流动相稀释得到分别含有UA 0.005、0.010、0.025、0.050、0.075、0.10 mg/mL,OA浓度为0.0025、0.005、0.0125、0.025、0.0375、0.050 mg/mL的混合标准溶液。

1.4.3 样品溶液的配制

将山楂果清洗干净,用小刀除去山楂果中硬核及其他杂质,在60 ℃恒温干燥3.0 h,得山楂果干。精密称取干燥后的山楂果干1 g左右,加30 mL乙醇溶液,在45 ℃、功率90 W下超声波处理40 min,待冷却、静置,取上层清液经0.45 μm滤膜过滤后,进行熊果酸和齐墩果酸的含量测定。

2.1 检测波长的选择

以甲醇溶液为参比,得到齐墩果酸和熊果酸的吸收光谱如图2所示,从图中可以看出两者的最大吸收波长分别为205和208 nm,考虑到甲醇的截止波长为205 nm,选择210 nm作为检测波长。

2.2 分离条件的选择

甲醇-水体系是反相色谱柱最为常用的体系,文献中报道了甲醇比例为85∶15[8]、88∶12[9]、87∶13[10]可以实现UA和OA的分离。本文据此考察了不同比例的甲醇-水体系对分离的影响,如图3所示。从图3中可以看出,随着流动相中甲醇的比例由85%到95%占比增加,两组分保留时间逐渐缩短,分离度逐渐下降,甲醇含量到95%时,两者已经不能实现基线分离。甲醇含量90%时分离情况较好,峰形尖锐,分离速度较快,综合考虑分析分离情况、峰形和分析时间,选择甲醇-水(90∶10, V/V)为流动相组成进行进一步条件优化。

图2 UA和OA的紫外吸收波谱

图3 UA和OA在不同流动相中的分离情况

熊果酸和齐墩果酸这类三萜酸类化合物由于带有羧基,将流动相的pH值控制在2.0～3.0之间,可以抑制三萜酸类化合物的离解,改善峰形并提高分离度[17]。很多文献中采用pH值为3.0的磷酸溶液控制流动相酸度。与磷酸相比,有机酸与流动相中的有机相互溶性更好,也更适合将方法推广到质谱检测器。与乙酸相比,甲酸酸性较强,较小浓度的酸,即可得到pH值为3.0的溶液。本文采用甲酸调节流动相pH值改善分离效果,如图4所示,加入甲酸后,UA和OA保留时间略有增加,但峰形和分离度得到很大改善,分离度由2.16增加到2.96,提高了方法的耐用性。故后续实验选用甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10, V/V)为流动相。

a. 流动相:甲醇-水(90∶10, V/V);b. 流动相:甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10, V/V)图4 流动相酸度对分离的影响

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

将混合标准溶液依次进样10 μL得到相应的色谱图,记录UA和OA的峰面积,分别以两者的峰面积对其浓度作图(图5)。UA色谱峰面积与浓度在0.005～0.10 mg/mL范围内呈良好线性,线性方程为:A=4017.6167c-0.60811(R2=0.99936);OA色谱峰面积与浓度在0.0025～0.05 mg/mL范围内呈良好线性,线性方程为:A=3713.0899c-0.06517(R2=0.999)。

图5 UA(a)OA(b)的标准曲线图

2.3.2 精密度实验

配制熊果酸浓度为0.10 mg/L,齐墩果酸浓度为0.05 mg/L的混合标准溶液,将其连续进样6次,每次进样10 μL,熊果酸峰面积的RSD为0.81%,齐墩果酸的峰面积的RSD为1.84%,表明该液相色谱条件系统适用性好(RSD≤2%)。

2.3.3 重复性实验

精密称取6份山楂果干,按照相同的条件和步骤制备样品溶液,进样10 μL,根据相应的色谱峰面积,计算得到UA峰面积的RSD为3.60%,OA的RSD为4.35%,重复性符合要求。

2.3.4 加标回收率实验

精密称取2份相同质量的山楂果干,其中1份加入已精密称定的熊果酸标准品0.4 mg和齐墩果酸标准品0.5 mg。按照相同的条件和步骤制备样品溶液,样品(图6a)和加标样品(图6b)的色谱图如6所示,经计算UA的加标回收率为97.5%,OA的回收率为98.0%。

a. 样品;b. 加标样图6 加标回收率试验色谱图

2.4 样品测定

精密称取6份山楂果干,按照相同的条件和步骤制备样品溶液,进样10 μL,根据相应的色谱峰面积代入线性回归方程,求得山楂中UA和OA的量分别为1.20 mg/g和0.57 mg/g。

本研究以Aupos Classical C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)为色谱柱,甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10, V/V)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温25 ℃,检测波长210 nm对齐墩果酸和熊果酸进行分离检测,并将该方法用于山楂中齐墩果酸和熊果酸的含量进行检测。该方法与现有测定山楂中两者成分的文献相比,具有流动相构成简单、出峰时间快、分离效果好、色谱分离前处理和后运行时间少等优点,可用于山楂果的质量控制研究。

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