基于GC-MS的6种石斛花朵挥发性成分分析*

徐坚旺,江海都,陈泰国,熊忠臣,韦 霄,柴胜丰**

(1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所,广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室,广西桂林 541006;2.桂林医学院药学院,广西桂林 541004)

石斛属(Dendrobium)为兰科(Orchidaceae)植物第二大属。在中国,石斛属植物种类超过80种,主要分布于云南、广西、贵州、四川、广东等省区[1]。石斛被誉为九大仙草之首,种类繁多,分布地区广。不同种类的石斛花朵具有不同的外部形态、花朵结构、颜色以及挥发性气味,且花期长,观赏性强,深受国人喜爱[2]。部分石斛除了观赏价值,还具有较高的药用价值,有抗癌[3]、抗氧化[4]等功效。植物的花香具有提高观赏价值、帮助繁育、抵御侵害等作用。研究人员从植物花朵中分析出的各种挥发性物质,促进了精油、护肤品等衍生产品的开发。吕素华等[5]采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术,从铁皮石斛(D.officinale)花朵中共分析出的51个挥发性成分以萜烯类、脂肪族类和芳香族类为主。王元成等[6]采用HS-SPME结合GC-MS技术分析了细叶石斛(D.hancockii)和翅梗石斛(D.trigonopus)花朵的赋香成分,共发现挥发性成分87个,细叶石斛花朵中含有52个,翅梗石斛花朵中含有35个,且主要成分种类皆为萜烯类,二者共有的主要成分为罗勒烯和β-石竹烯。

传统的植物挥发油成分提取方法主要有水蒸气蒸馏法(SD)、索氏提取法等[7],传统方法成本低,但耗材过多,提取效率低。固相微萃取法(SPME)是将取样、浓缩、进样一体化,可结合其他检测仪器联合使用,具有检测快速、重现性好等特点[8,9]。宋小蒙等[10]分别采用SPME和SD两种方法提取金钗石斛(D.nobile)花朵挥发性成分,发现两种方法虽然共鉴定出69种化合物,但两者相差较大,其中采用SPME方法分析出63种化合物,而采用SD法仅分析出24种化合物。因此,本研究使用SPME法结合GC-MS技术,测定并分析罗河石斛(D.lohohense)、球花石斛(D.thyrsiflorum)、喇叭唇石斛(D.lituiflorum)、紫瓣石斛(D.parishii)、黄石斛(D.catenatum)和始兴石斛(D.shixingense)花朵的挥发性成分,拟为香型石斛的繁育及其精油、化妆品等衍生产品的开发提供参考。

1.1 材料

供试材料为栽培于广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所石斛种质资源圃的罗河石斛、球花石斛、喇叭唇石斛、紫瓣石斛、黄石斛和始兴石斛。

1.2 仪器

手动固相微萃取进样器(美国SUPELCO公司),50 mL棕色螺纹取样瓶,气相色谱-质谱仪GC-MS (6890N-5975B,美国Agilent公司),水浴锅(上海精学科学仪器有限公司)。

1.3 GC-MS分析

根据不同石斛的花期,在2022年5月上旬10:00-12:00,摘取6种石斛正在盛开的花朵,平均每种采摘5朵,放入50 mL棕色螺纹取样瓶中保存,插入提前处理好的50/30 μm PDMS/CAR/DVB 纤维头,设置温度为40 ℃,顶空萃取30 min。萃取结束,将纤维头拿出,使用GC-MS进行分析。每种实验重复3次。

色谱条件:HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);流速1 mL·min-1;载气为高纯度氦气(99.99%),不分流模式。程序升温:进样口温度250 ℃,起始柱温35 ℃保持2 min,先以5 ℃·min-1升至80 ℃,再以8 ℃·min-1升至180 ℃,最后以8 ℃·min-1升至250 ℃。

质谱条件:进样口温度维持在250 ℃,离子源温度为230 ℃,电离方式为EI,电子能量70 eV,GC-MS传输线温度为250 ℃,扫描范围为30-500 amu。

1.4 鉴定方法

通过SPME法结合GC-MS技术得到6种石斛花朵的总离子流色谱图,将色谱图中各个波峰进行解析,得到相应的质谱图,最后使用软件Xcalibur1.2和美国国家标准与技术研究院(NIST98)中的标准物质谱图库及相关文献中的物质数据进行比对,用离子流峰面积归一化法计算所检测出的挥发性成分的相对含量总占比。

2.1 6种石斛花朵中挥发性成分类别比较

根据6种石斛花朵中挥发性成分检测结果,共鉴别出106种挥发性物质,其主要成分的种类为萜烯类、烷烃类、芳香族化合物、酯类、含氮化合物、酮类、醇类(表1)。由表1可知,不同种类石斛花朵挥发性成分的类别均不相同,6种石斛花朵的挥发性成分均含有萜烯类和烷烃类,罗河石斛和喇叭唇石斛萜烯类成分的相对含量较高,分别是88.68%和87.64%。球花石斛和黄石斛烷烃类成分的相对含量较高,分别为72.38%和40.47%。紫瓣石斛和黄石斛的烷烃类和酯类成分相对含量较高,紫瓣石斛的含量分别为31.42%、41.73%,黄石斛的含量分别为40.47%、39.19%。始兴石斛与其他5种石斛不同,其组分中的醇类与烷烃类成分相对含量较高,分别为44.61%、32.57%。

表1 6种石斛的挥发性成分类别

球花石斛花朵的挥发性成分含有20种物质,其中有14种烷烃类成分,3种萜烯类成分,1种酮类,2种醇类,除烷烃类成分外,萜烯类、酮类、醇类的相对含量分别为17.45%、5.36%、4.83%。罗河石斛的挥发性成分含有18种物质,其中有11种萜烯类成分,4种烷烃类成分,1种芳香族化合物,1种酯类成分,1种含氮化合物,除萜烯类成分外,其余挥发性成分种类相对含量分别为7.48%、1.67%、1.29%、0.88%。喇叭唇石斛的挥发性成分所含物质最多,有45种,其中有20种萜烯类成分,10种烷烃类成分,7种芳香族化合物,4种酯类成分,3种酮类,1种醇类,除萜烯类成分外,其余挥发性成分种类相对含量相对较少,分别为3.47%、3.98%、4.42%、0.36%、0.13%。紫瓣石斛含有13种组分,其中2种酯类和2种烷烃类成分相对含量较高,分别为41.73%和31.42%,其余种类成分相对含量较低,1种萜烯类成分,3种芳香族化合物,3种含氮化合物,2种酮类,分别为3.21%、4.39%、4.90%、14.34%。黄石斛含有21种组分,其中5种烷烃类和2种酯类成分相对含量较高,分别为40.47%和39.19%,其余种类相对含量较低,3种萜烯类成分,1种芳香族化合物,6种含氮化合物,2种酮类,1种醇类,分别为5.17%、1.32%、11.13%、1.64%、1.10%。始兴石斛的挥发性成分含有11种物质,其中3种烷烃类和3种醇类成分相对含量较高,分别为32.57%和44.61%,其余种类相对含量较低,4种萜烯类成分,1种酮类成分,相对含量分别为15.35%、7.48%。结果表明,不同种类的石斛花朵中挥发性成分类别和相对含量均存在差异,所含类别数量和相对含量并无明显的关系。

2.2 6种石斛花朵挥发性成分分析

表2统计了采用SPME结合GC-MS技术从6种石斛花朵中所检测出化合物匹配度≥80的挥发性成分。由表2可知,在6种石斛花朵中共检测出106种挥发性物质。6种石斛花朵中均含有十甲基环戊硅氧烷,其在罗河石斛、喇叭唇石斛中相对含量较低,分别为1.35%、0.96%;在球花石斛、紫瓣石斛、黄石斛、始兴石斛中相对含量均较高,分别为22.04%、25.86%、20.58%、21.66%,十甲基环戊硅氧烷是球花石斛、紫瓣石斛、黄石斛、始兴石斛的主要挥发性成分之一。罗河石斛与喇叭唇石斛的挥发性成分以萜烯类为主,α-蒎烯、β-水芹烯、D-柠檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯在罗河石斛中相对含量较高,分别为26.66%、22.96%、13.77%、9.31%、6.06%;喇叭唇石斛有45个挥发性成分,罗勒烯和佛术烯是其主要成分,二者的相对含量分别为73.98%和5.66%。紫瓣石斛和黄石斛挥发性成分的主要成分为酯类和烷烃类,{双[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯为紫瓣石斛挥发性成分的主要成分,相对含量为41.40%;对甲苯甲酸十八烷基酯为黄石斛挥发性成分的主要部分,相对含量为37.96%。始兴石斛较其他5种石斛不同,3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇为始兴石斛挥发性成分的主要组成部分,其相对含量为39.86%。八甲基环四硅氧烷在球花石斛、黄石斛中均被检测到,但相对含量较少,分别为1.72%、2.26%;石竹烯在球花石斛和喇叭唇石斛中均有被检测到,相对含量分别为6.59%、2.61%;α-荜澄茄油烯在紫瓣石斛和黄石斛中均被检测到,相对含量较少,分别为3.21%和1.37%;桉树醇在黄石斛和始兴石斛中均被检测到,相对含量较少,分别为1.10%和2.56%;(1R)-(+)-α-蒎烯在球花石斛和罗河石斛中均有存在,但在球花石斛中相对含量较多,为9.12%,罗河石斛中相对含量较少,为0.93%;罗勒烯在喇叭唇石斛为主要成分,但在黄石斛中相对含量较少,仅为1.46%;α-蒎烯在罗河石斛和始兴石斛均有存在,但在罗河石斛中含量较高,在始兴石斛中含量较低,仅为6.52%;β-月桂烯和D-柠檬烯在罗河石斛和喇叭唇石斛中均被检测到,但其在罗河石斛中含量相对较高,分别为9.31%和13.77%,在喇叭唇石斛中仅分别为0.21%、0.10%。

表2 6种石斛花挥发性成分分析

除各石斛挥发性成分的共同组分之外,还存在个别的特殊挥发性成分。1,3,5,7,9-五乙基环戊硅氧烷仅在喇叭唇石斛中被检测到,其相对含量较少,为0.17%;3,3-二甲基己烷仅在球花石斛中被检测到相对含量为9.07%;β-水芹烯仅在罗河石斛中被检测到,且相对含量较高,为22.96%。2-十三酮仅在紫瓣石斛中被检测到,相对含量为10.78%;1,3,5,7,9-五乙基环五硅氧烷仅在黄石斛中被检测到,相对含量为11.13%。

3.1 6种石斛花朵中主要赋香成分

花香是由花朵自然产生的一种芳香物质,属于植物释放的次级代谢产物。不同的花香含有不同的挥发性物质,其中相对含量较高且香气值(释放浓度/嗅感阈值)较大的挥发性物质,可推测其为香味的主要赋香成分[11,12]。研究报道,十甲基环戊硅氧烷以及硅氧烷化合物被广泛用于化妆品、精油等个人洗护产品中的芳香剂、除臭剂等[13-15]。α-蒎烯、β-水芹烯、D-柠檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯、石竹烯、罗勒烯、佛术烯等物质为香味的主要赋香成分,可提供丰富的香气[16,17]。罗勒烯具有植物香味并伴有橙花油气息,甜香味强烈,常被作为各种精油产品的香味添加剂[18];D-柠檬烯为单环单萜烯,似甜橙清新香味,有抗炎、抗菌等药理作用[19,20],香气阈值为10 g/m3[21];月桂烯具有清淡的香脂气味,有抗炎、抗氧化等药理作用[22,23],香气阈值为13-15 g/m3[21];石竹烯为辛香、木香和温和的丁香香味,让人心旷神怡,具有平喘、消痰等药理作用[24-27]。各种酯类物质也是花香的重要组成部分,例如苯甲酸甲酯具有清新的甜香味[28],水杨酸甲酯具有特殊草药气味,且有消炎、止痛等药理作用[29]。

α-蒎烯、β-水芹烯、D-柠檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯在罗河石斛中相对含量较高,分别为26.66%、22.96%、13.77%、9.31%、6.06%,α-蒎烯、β-水芹烯可能是罗河石斛的主要赋香成分,D-柠檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯为次要赋香成分。十甲基环戊硅氧烷、(1R)-(+)-α-蒎烯、石竹烯在球花石斛中相对含量较高,分别为22.04%、9.12%、6.59%,其中十甲基环戊硅氧烷可能是球花石斛的主要赋香成分之一,(1R)-(+)-α-蒎烯、石竹烯可能是其次要赋香成分。罗勒烯在喇叭唇石斛中的相对含量高达73.98%,这一成分可能是其独特的赋香成分。紫瓣石斛、黄石斛和始兴石斛均被检测出独特的挥发性成分,{双[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯在紫瓣石斛中相对含量为41.40%,可能是其特征香气成分;黄石斛中对甲苯甲酸十八烷基酯的相对含量为37.96%,可能是其主要独特的香气成分;3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇是始兴石斛中的特征性成分,相对含量为39.86%,可能是其主要赋香成分之一。

3.2 6种石斛花朵中挥发性成分差异分析

本研究主要采用SPME法结合GC-MS技术分析了6种石斛花朵的挥发性成分种类及其相对含量,共鉴别出106种挥发性物质,主要成分种类为萜烯类、烷烃类、芳香族化合物、酯类、含氮化合物、酮类、醇类。6种石斛花朵中挥发性成分检测数量为11-45种,个别石斛存在较大差异。始兴石斛鉴别出11种成分,含有独特的挥发性成分,其主要成分为醇类,而这类物质在其他5种石斛中含量极小或者未被检测出来。喇叭唇石斛挥发性成分较其他石斛复杂,具体体现在挥发性成分数量较多,共鉴定出45种香气成分,同时含有6类挥发性成分,其主要成分为萜烯类。黄石斛所含挥发性成分类别最多,有7类挥发性成分,但其香气成分只有21种,其主要成分为烷烃类和酯类。球花石斛主要的挥发性成分为烷烃类,罗河石斛和喇叭唇石斛较为相近,主要的挥发性成分为萜烯类。紫瓣石斛和黄石斛均以烷烃类和酯类为主。6种石斛的挥发性成分差异较大,仅十甲基环戊硅氧烷为其共有成分,且每种石斛主要香气成分皆不相同。十甲基环戊硅氧烷在球花石斛、紫瓣石斛、黄石斛、始兴石斛中含量均较高,但在罗河石斛和喇叭唇石斛中含量极小。曹桦等[30]对4种香花型石斛盛花期花朵的挥发性成分进行测定和分析,共鉴定出挥发性成分80种,其中共有挥发性成分仅有2种,4种香花型石斛的挥发性成分及相对含量具有明显差异,均含有其特征香气成分。王元成等[31]采用SPME法结合GC-MS技术研究5种石斛花朵的挥发性成分,共鉴定出110个成分,花香成分以萜烯类化合物为主,其中罗勒烯、D-柠檬烯、芳樟醇相对含量较高;检测的棒节石斛(D.findlayanum)的独有成分有14个,5种石斛花朵之间的挥发性成分存在明显差异。颜沛沛等[32]研究1 d内6个不同时间点报春石斛(D.polyanthum)花朵中挥发性成分的相对含量变化,发现乙酸乙酯在下午时间段的相对含量较高,但是王元成等[31]在上午采样中,并未发现此成分,其余主要成分大致相同。李崇晖等[33]研究鼓槌石斛(D.chrysotoxum)和细叶石斛(D.hancockii)花朵中3-蒈烯的相对含量均最高,均未检测到顺式-β-罗勒烯,(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛中含量极低,石竹烯在细叶石斛中未被检测出。夏科等[34]检测到的鼓槌石斛中顺式-β-罗勒烯和(1R)-(+)-α-蒎烯含量较高,但并未检测到3-蒈烯,细叶石斛中顺式-β-罗勒烯和石竹烯相对含量较高。李崇晖等[33]与夏科等[34]对相同种的石斛的香气成分检测结果存在差异。

这些研究结果表明,石斛属不同种之间的花朵挥发性成分数量和含量均存在差异,甚至相同种石斛挥发性成分检测也可能存在差异,原因可能是石斛种植地域和生长环境因子的不同,也可能是对石斛花朵挥发性成分提取的方法不同,还可能是石斛花朵中挥发性成分以及含量会随着开花时间的变化而变化,不同的采样时间也会导致挥发性成分存在差异。

本研究采用SPME法结合GC-MS技术,分析了6种石斛花朵的挥发性成分种类及其相对含量。共鉴别出106种挥发性物质,主要成分种类为萜烯类、烷烃类、芳香族化合物、酯类、含氮化合物、酮类、醇类。6种石斛花朵的挥发性成分均含有萜烯类和烷烃类,并且这两类成分均为6种石斛花朵的主要挥发性成分。6种石斛均含有十甲基环戊硅氧烷,但相对含量存在差异。球花石斛主要赋香成分为十甲基环戊硅氧烷;罗河石斛主要特征香气成分为α-蒎烯、β-水芹烯;喇叭唇石斛的独特香气成分为罗勒烯;紫瓣石斛的主要赋香成分为{双[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯和十甲基环戊硅氧烷;黄石斛的主要特征香气成分为对甲苯甲酸十八烷基酯和十甲基环戊硅氧烷;始兴石斛的独特香气成分为3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇和十甲基环戊硅氧烷。不同种类的石斛花朵挥发性成分不同,主要成分的组成和相对含量存在较大差异,研究结果对香型石斛种类的选育及其衍生产品的开发具有重要参考价值。

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