响应面法结合超声辅助提取乌梅总黄酮工艺研究

刘丽军 ,姚李欣 ,卢文芳 ,王金梅 ,张娟娟✉

1 河南大学 淮河医院,河南 开封 475000;2 黄河科技学院 河南省食药两用植物资源综合利用工程技术研究中心,郑州 450063;3 河南大学 国家食用菌加工技术研发专业中心,河南 开封 475004

乌梅为蔷薇科杏属植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥近成熟并烘制的果实,作为药材首次记载于《神农本草经》,其性平,味酸,涩,归肝、脾、肺、大肠经。乌梅为药食同源中药材,具有敛肺止咳、涩肠止泻、消肿解毒、生津止渴和安蛔等功效[1]。常见的乌梅炮制品包括净乌梅、乌梅炭、乌梅肉和醋乌梅,其主要化学成分为有机酸类、糖类、脂类、甾醇类、生物碱类、黄酮类、萜类等[2-3]。现代药理学研究[4-6]显示,乌梅具有抑菌、镇咳、抗肿瘤、抗氧化等作用。随着研究的深入,在现代医学中乌梅及其提取物已开始应用于临床,并在抗过敏[7]、口腔抑菌[8]、止泻[9]等方面开始发挥重要作用。

植物中总黄酮的常用提取方法包括浸取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解提取法、超临界流体萃取法等,其中超声辅助提取已被证明在辅助植物材料提取过程中可以显著缩短提取时间和提高提取率。在超声应用过程中,会产生空化效应和机械效应,从而使溶剂更容易渗透到植物原料中,破坏植物细胞壁,促进有效成分释放[10-11]。因此,本试验选用超声辅助提取乌梅总黄酮,在单因素试验的基础上通过响应面法优化乌梅总黄酮的提取工艺,为其进一步开发利用提供参考依据。

1.1 实验材料

乌梅(购自张仲景大药房,样品保藏于河南省黄河科技学院药用资源综合利用重点实验室);芦丁对照品(黄河科技学院河南省食药用植物资源综合利用工程技术研究中心提供,纯度达98%以上);无水甲醇、乙醇(天津市富宇精细化工有限公司);硝酸铝、亚硝酸钠(天津市德恩化学试剂有限公司)。

BSA224S型电子天平(德国赛多利斯公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(500 W、40 kHz,昆山市超声仪器有限公司);高速多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称量25 mg芦丁标准品置50 mL容量瓶,加无水乙醇溶解定容至刻度,摇匀得0.5 mg/mL芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分别置于10 mL可密封试管中,各加水至5 mL,混合摇匀;分别加质量分数为5%的NaNO2溶液0.6 mL,摇匀后静置6 min。加入质量分数为4%的NaOH 溶液3.0 mL,加水至刻度线,摇匀后静置15 min,于506 nm 波长处吸测定光度A。以芦丁浓度c为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制标准曲线[12-13],如图1所示:

图1 芦丁标准曲线

1.2.2 乌梅总黄酮的提取

称取干燥乌梅200 g,粉碎后过30目筛。称取1.0 g的乌梅粉置于锥形瓶中,在一定的甲醇料液比、提取温度和提取时间的条件下进行总黄酮的超声提取,然后将得到的提取液过滤,定容至25 mL容量瓶,备用。

1.2.3 乌梅总黄酮的测定

准确量取样品溶液0.3 mL于10 mL 比色管中,按照1.2.1节中所述方法进行操作,按下式计算黄酮提取量。

式中:W表示黄酮提取量,mg/g;c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度,mg/mL;D表示溶液的稀释倍数;m 表示药材的取样量,g。

1.2.4 单因素实验

采用1.2.2节中乌梅总黄酮的提取方式,料液比(1∶20 g/mL,1∶30 g/mL,1∶40 g/mL,1∶50 g/mL,1∶60 g/mL,1∶70 g/mL)、粉碎目数(10,20,30,40,50,60 目)、提取温度(10 ℃,20 ℃,30 ℃,40 ℃,50 ℃,60 ℃)和提取时间(20 min,30 min,40 min,50 min,60 min,70 min)这4个因素作为单因素实验条件,考察单因素对乌梅中总黄酮提取量的影响。

1.2.5 响应面实验设计

综合单因素实验,选取料液比(X1)、粉碎目数(X2)、提取温度(X3)和提取时间(X4)为响应面模型的自变量。以乌梅中总黄酮提取量为评价指标,运用Design-Expert 8.0.6软件设计,每个因素共涉及高、低、中三个水平分别用 1、0、-1表示,变量水平见表1。

表1 Box-Behnken法试验设计因素和水平

1.2.6 数据分析

实验中依次改变单一变量料液比、粉碎目数、提取温度和提取时间,各试验均平行3次,结果取平均值。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计与数据统计分析。

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对乌梅总黄酮提取量的影响

由图2可知,随着料液比的增加,乌梅总黄酮提取量逐渐增加,当固液比为1∶60时,乌梅总黄酮提取量达到最大,继续增大料液比,提取率反而趋于下降。可能是因为随着料液比的继续增加,溶剂的渗透压增大,导致其他杂质溶出,目标分析物的提取率下降。料液比过小会导致药材内的有效成分提取不完全,而过大又会造成溶剂的浪费,因此选择固液比1∶60。

图2 料液比对乌梅总黄酮提取量的影响

2.1.2 粉碎目数对乌梅总黄酮提取量的影响

中药有效成分提取时,药材粉碎大小对提取率影响很大。药材粉碎颗粒越小,与溶剂的有效接触面积就越大,提取率越高。在上述优化条件的基础上,考察粉碎目数分别为10、20、30、40、50、60目时,对乌梅总黄酮提取量的影响。结果见图3。40目分样筛对梅总黄酮提取量最高,这是因为粉末粒度越小,样品中含有的有效成分越易被提取,但当粉末粒度太小时,容易被溶剂凝聚成团,从而阻碍有效成分的释放[14]。因此选择过筛目数40目。

图3 粉碎目数对乌梅总黄酮提取量的影响

2.1.3 提取温度对乌梅总黄酮提取量的影响

在上述优化条件的基础上,考察超声温度分别为10、20、30、40、50、60 ℃时,对乌梅总黄酮提取量的影响。结果如图4所示,随着提取温度的升高,目标分析物提取率逐渐增大,当提取温度为50 ℃时,提取率最大,但温度继续升高,提取率出现不断降低的趋势。原因可能是继续升高体系的温度,过高的温度会使总黄酮中结构被破坏;也可能因为随着温度升高,细胞中其他内容物溶出增多,导致溶液黏度增大,影响目标分析物向外溶出,从而使提取率下降。所以,选择提取温度50 ℃。

图4 提取温度对乌梅总黄酮提取量的影响

2.1.4 提取时间对乌梅总黄酮提取量的影响

在上述优化条件的基础上,考察提取时间分别为20、30、40 min、50、60、70 min时,对目标分析物提取率的影响,结果如图5。随着超声波提取时间的增加,乌梅总黄酮提取量都有所增加,当超声波时间增加至60 min时,提取率均达到顶峰,超声波提取时间继续增加,提取率趋于下降。其原因可能是总黄酮提取量基本达到饱和,不再明显溶出。此外,提取时间过长会破坏异黄酮类化合物的结构,提取率下降[15]。因此,本试验选择超声波提取60 min为最优条件。

图5 提取时间对乌梅总黄酮提取量的影响

2.2 Box-Behnken响应面法结果与分析

2.2.1 响应面优化设计试验结果

结合上述实验结果,以料液比(X1)、粉碎目数(X2)、提取温度(X3)和提取时间(X4)为考查对象,以乌梅总黄酮提取量(Y)为响应值,调整提取方案(见表2)。利用 Design-Eepert 8.0.6对试验数据进行二次多项式逐步回归拟合,建立二次多元回归方程:

表2 响应面试验方案和结果

回归模型方差分析见表3。

表3 响应面模型方差分析

由表3 可知,回归模型具有极显著性(P＜0.001),失拟项不显著(P＞0.05),说明该模型成立。模型的决定系数R2=0.966 8,校正决定系数=0.933 7,模型的决定系数R2和校正决定系数均较高且接近,说明模型准确性和通用性较高,可以用来分析和预测离子液体对3个目标化合物提取的效果。一次项X1,交互项X1X3、X1X4、X2X4、X3X4,二次项、对乌梅总黄酮提取量均有极显著的影响(P＜0.01);二次项对乌梅总黄酮提取量具有显著影响(P＜0.05);一次项X2、X3、X4,交互项X1X2、X2X3,二次项差异不显著(P＞0.05)。单因素的P值大小也反映了各因素对目标化合物提取效率的影响程度。从结果来看,对乌梅总黄酮提取量影响最大的因素是料液比(X1)。

响应曲面图可以显著反映各因素之间相互作用的强弱,采用Design-Exper软件对响应曲面图进行分析,可以得到各因素交互作用对响应值的影响,结果见图6。如果响应曲面较陡峭,说明该因素对乌梅总黄酮提取量的影响较大,响应值对于提取条件的改变就越敏感;如果响应曲面相对平缓,说明该因素的波动对响应值的影响较小[16]。由图6,从响应面图陡度可以看出来,料液比、提取时间相互作用最强烈,粉碎目数、提取温度因素相互作用最弱。随着料液比的增加,乌梅总黄酮提取量缓慢增加到最大值时,然后逐渐下降。随着粉碎目数的增加提取率不断增加,之后随粉碎目数的增加,提取率变化不大。

图6 各因素交互作用总黄酮提取量的响应面与等高线图

2.2.2 最佳工艺的确定及试验验证

通过 Design-Exper 软件对回归方程进一步分析预测,取整数调整得出最佳工艺参数为:料液比,50 mL/g;粉碎目数,30目;提取温度,40 ℃;提取时间,70 min。在此最佳工艺条件下,对建立的数学模型进行验证实验,乌梅总黄酮提取量实际测得值为63.19 mg/g,与预测值(62.77 mg/g)相近,说明响应面分析法所得乌梅总黄酮的最优工艺参数准确可靠。

本课题在单因素试验的基础上,利用响应面法优化了乌梅总黄酮的超声提取工艺。结果表明,在料液比50 mL/g、粉碎目数30目、提取温度40 ℃和提取时间70 min的条件下,乌梅总黄酮的提取量为63.19 mg/g。与传统提取方法相比,超声提取乌梅总黄酮时间更短,效率更高。与单因素方法相比,响应面法所得的料液比50 mL/g和提取温度40 ℃低于单因素方法的料液比60 mL/g和提取温度50 ℃,从经济角度考虑,低料液比和提取温度更节约成本和能耗。因此,本研究结果可为乌梅总黄酮的有效提取提供依据。

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