ICARDA引进-小麦苗期抗旱性的全基因组关联分析

张颖，石婷瑞，曹瑞，潘文秋，宋卫宁，王利，聂小军

ICARDA引进-小麦苗期抗旱性的全基因组关联分析

张颖1，石婷瑞1，曹瑞1，潘文秋1，宋卫宁1，王利2，聂小军1

1西北农林科技大学农学院/作物抗逆与高效生产全国重点实验室，陕西杨凌 712100；
2山东省农业科学院农业资源与环境研究所/养分资源高效利用全国重点实验室，济南 250100

【目的】干旱是限制小麦生产最主要的逆境因子之一。挖掘、鉴定优异抗旱新种质、克隆抗旱新基因，以期丰富我国小麦抗旱遗传基础，为小麦抗旱遗传改良提供材料。【方法】以198份从国际干旱地区农业研究中心（ICARDA）引进的抗旱种质为材料，采用PEG-6000模拟干旱方法，通过调查苗期干旱和正常条件下的地上部鲜重、地下部鲜重、生物量和根冠比4个性状，鉴定、评价其抗旱性，结合660K SNP芯片对其抗旱性进行全基因组关联分析，发掘抗旱性相关染色体区间及关联位点，结合干旱胁迫下根等多组织的表达量数据，筛选抗旱性相关基因，最后以强抗旱性品系IR214和干旱敏感品系IR36为材料，利用qRT-PCR方法对候选基因进行验证，并分析关键候选基因的优异单倍型。【结果】干旱胁迫下，小麦的生长发育受到显著抑制，各性状表型均显著低于正常对照，不同小麦品系间也表现出显著差异，4个性状在2种处理下均呈现正态分布，变异系数为0.363—0.760，多样性指数为0.310—0.400；
基于加权隶属函数值（值）综合评价各个品种的抗旱性，发现品系IR214的值最大，为0.851，其次为IR92、IR213、IR235和IR218等，它们可作为新的优异抗旱种质；
在此基础上，通过全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS），共检测到102个与4个性状抗旱系数显著关联的SNP位点，表型变异解释率范围为1.07%—38.70%，其中，与地上部鲜重相关的位点60个、地下部鲜重相关位点1个、生物量相关位点36个以及根冠比相关位点5个；
基于基因组注释信息，筛选到31个抗旱相关基因，结合根等不同组织的RNA-seq数据，筛选出4个抗旱候选基因，对差异表达的候选基因进行qRT-PCR验证，鉴定到2个关键抗旱候选基因；
最后，分析候选基因的单倍型效应，发现的AX-86174509位点，2种基因型在抗旱性状上具有显著差异，是潜在的功能位点。【结论】共检测到102个与苗期抗旱性显著关联的位点，筛选出和2个关键候选基因，的AX-86174509位点是潜在的抗旱性功能位点。

小麦；
干旱胁迫；
660K SNP芯片；
全基因组关联分析；
候选基因

【研究意义】小麦（L.）是世界三大粮食作物之一，其种植面积约占全世界总耕作面积的17%，是全球近30%人口的主粮[1]。在我国，小麦也是最重要的粮食作物之一，常年种植面积约2 400万hm2，年产量超过1亿t[2]。小麦的持续增产稳产对保障我国乃至全世界粮食安全有着举足轻重的影响。随着全球气候变化，极端天气日益频发，水资源短缺、降雨不均、季节性干旱等问题日趋严峻。干旱已成为限制小麦生产最重要的逆境因子。干旱抑制小麦的生长，会导致小麦株高减小、叶片失水、气孔关闭、净光合速率和气孔导度下降、叶面积减小，从而引起减产[3]。同时，干旱还会干扰小麦的生理和代谢过程，使其更容易受到病虫害的侵害。据统计，每年因干旱而造成的小麦产量损失超过其他逆境和病虫草害的总和[4]。苗期是小麦生长发育的关键时期，通过影响器官形态建成来影响整个生长发育进程。干旱胁迫下，小麦幼苗的许多形态和生理特征发生改变，包括叶片变小、根长缩短和渗透势降低等[5]。同时，干旱也会影响小麦地上部与地下部生物量[6-7]。生物量一直是评价植物抗旱性的重要指标之一[8]。干旱胁迫下植物的根冠比会升高[9]，高根冠比的小麦可以吸收深层土壤水分，从而保证较高的蒸腾效率以适应干旱胁迫[10]。因此，系统解析小麦苗期抗旱性的遗传基础，鉴定、发掘优异苗期抗旱新基因，对小麦抗旱遗传改良、保障粮食安全具有重要意义。【前人研究进展】小麦抗旱性是一个复杂的数量性状，涉及诸多基因和多种机制的协同作用。全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）是一种以连锁不平衡为基础，通过群体分析，在全基因组水平上鉴定与性状相关联的标记或基因的研究策略，为数量性状基因挖掘和复杂性状的遗传基础解析提供了不可或缺的重要方法[11]。前人围绕小麦苗期抗旱性的GWAS分析和遗传基础解析已开展了大量工作。Maulana等[12]以200个代表性的冬小麦品系组成的自然群体为材料，基于90K SNP芯片的全基因组关联分析，共鉴定了12个稳定的苗期抗旱性相关SNP位点，分别位于1B、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4B、5A、5B、6B和7B染色体。王博华等[13]利用90K SNP芯片对300份国内外小麦品种（系）基于最长根长、根总长、根表面积、根体积、根平均直径、根尖数、根鲜重和根干重等8个性状的苗期抗旱系数进行全基因组关联分析，共鉴定到41个显著关联位点，并筛选到11个与小麦抗旱性相关的候选基因。同时，基于GWAS分析等正向遗传学分析，多个小麦抗旱关键基因也被鉴定和克隆，包括[14]、[15]、[16]等。【本研究切入点】尽管前人已对小麦抗旱性相关位点及其候选基因发掘开展了较多研究，但我国小麦遗传基础较为狭窄，基因同质化较高，迫切需要加强新抗旱种质和基因的发掘和利用，以丰富我国小麦抗旱基因资源、扩宽遗传基础。【拟解决的关键问题】本研究以引自国际干旱地区农业研究中心的198份优异抗旱小麦品种（系）为材料，利用PEG600模拟干旱方法，调查、统计其苗期地上部鲜重、地下部鲜重、生物量、根冠比等4个指标来评价其抗旱性，筛选优异抗旱种质；
在此基础上，结合660K SNP芯片进行苗期抗旱性的全基因组关联分析，发掘新的小麦苗期抗旱性相关SNP位点，鉴定其候选基因，以期为小麦抗旱遗传改良奠定材料基础，为其分子设计育种提供有用标记信息。

1.1 供试材料

供试材料为198份小麦品种与育种中间材料组成的关联分析群体，由西北农林科技大学宋卫宁教授从国际干旱地区农业研究中心的种质基因库引进，并由西北农林科技大学农学院植物基因组学课题组保存。

1.2 试验设计及表型调查

2020年3月中旬，于西北农林科技大学科研温室进行室内水培试验，试验采用完全随机设计，首先，选取大小均匀一致、籽粒完整饱满的种子30粒，用75%乙醇浸泡3 min，再用2%次氯酸钠消毒3次，随后用双蒸水冲洗3—5次，洗去种子表面残留的次氯酸钠，将种子置于铺有双层滤纸的培养皿中萌发，待其露白，长至一叶一心期时，选取大小长势一致的幼苗移至水培容器中，每个水培盆种24个品种，每个品种种植6株，设置对照组和处理组，3次生物学重复，随机区组设计。每个容器加20 ml Hoagland营养液，利用氧气泵通气，每3天更换一次Hoagland营养液。待幼苗长至两叶一心期时，加入PEG6000进行模拟干旱胁迫，在干旱处理时，浓度随时间逐级递加至最终浓度为19.2%，胁迫处理21 d后进行表型调查。同时，以未添加PEG6000的Hoagland营养液作对照处理。

表型调查指标包括地上部鲜重、地下部鲜重、生物量和根冠比，具体方法为收获正常和干旱处理植株的地上部和地下部，采用分析天平称量鲜重，生物量为地上部与地下部鲜重之和，根冠比为地下部鲜重与地上部鲜重的比值。3次生物学重复。

1.3 表型数据分析

利用Excel对地上部分鲜重、地下部分鲜重、生物量和根冠比的观测值进行整理，并计算每个材料的抗旱系数。利用隶属函数法将每个指标的抗旱系数转换为隶属函数值。为了确定每个指标在计算抗旱系数中的权重，将每个指标的变异系数与其他指标的变异系数进行比较，并计算其占比作为权重。最后，计算每个材料在各重复下的加权隶属函数值（值）[17]。

抗旱系数=干旱胁迫测定值/对照处理测定值

(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X为各供试材料基于鉴定指标的抗旱系数，Xmax、Xmin分别为供试材料中X的最大值和最小值，(X)为各供试材料X的隶属函数值，CV为各供试材料(X)的变异系数，W表示CV在总变异中所占比率。

1.4 基因型测序分型

从实验室前期数据中提取198份引进材料的660K SNP芯片基因分型信息[18]。对获得的198份材料的基因型数据进行质量控制，以缺失率（miss）＜0.2、最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.05为标准过滤筛选，最终得到319 800个高质量的SNP标记位点用于后续分析。采用Power Marker V3.25软件分析参试材料的遗传多样性和多态性信息含量（polymorphic information content，），=1-∑(P)2（P表示位点的第个等位变异出现的频率）。利用Admixture 1.3.0软件进行群体结构分析，设置K=1—10，每个K值重复5次；
利用PopLDdecay软件计算其衰减距离（linkage disequilibrium，LD）。

1.5 全基因组关联分析

基于筛选获得的高质量SNP标记，以198份小麦品种4个指标计算的抗旱系数为表型，利用TASSEL v5.0软件中的MLM混合线性模型进行全基因组关联分析，显著关联阈值估计为＜0.01/N，N为有效SNP个数，判定SNP标记与目标性状关联的显著性，利用R语言绘制关联分析结果的曼哈顿图和Q-Q图。

1.6 候选基因筛选

根据从Ensemble plants数据库（http://plants.ensembl.org/index. html）下载基因注释信息，结合LD区间，筛选候选基因。从SRA公共数据库下载中国春小麦干旱胁迫下根、叶、冠、孕穗期、开花、籽粒形成和花药分化等多个组织和阶段的转录组数据[19]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA369686），使用fastp v0.21.0去除低质量数据后，由HISAT2 v2.1.0将序列比对至中国春参考基因组（IWGSCv2.1），利用samtools v1.3.1进行排序并构建索引，由stringtie v2.1.4组装转录本，并统计基因丰度表达，使用R包DESeq2 v1.31.0进行差异基因分析，选取显著差异表达的基因为作物抗旱性候选基因（差异倍数＞2且＜0.05）。为验证关键候选基因，以抗旱性最强的IR214和干旱最敏感的IR36为材料，收集其在对照和20% PEG条件下分别处理0、6、12、24和48 h的叶片样本，提取RNA并反转录，对关键候选基因进行qRT-PCR验证。根据验证后的关键候选基因中与干旱耐受性显著关联的SNP位点将供试材料分为2类（仅选择纯合基因型），并使用检验分析基因型对表型的效应。使用R包ggplot2 v3.4.1绘制箱线图。

2.1 ICARDA小麦苗期抗旱性的鉴定

通过调查和比较198份引进小麦种质在PEG6000模拟干旱和正常对照条件下的地上部鲜重、地下部鲜重、生物量和根冠比4个性状（图1-A—D，附表1），发现干旱胁迫会显著抑制小麦的生长发育、降低苗期生物量。正常条件下的地上部鲜重为0.216—3.029 g，而干旱胁迫下的地上部鲜重为0.187—2.495 g；
正常和干旱胁迫下的地下部鲜重分别为0.118—1.368 g和0.116—1.114 g，正常和干旱胁迫下的生物量分别为0.389—4.397 g和0.303—3.608 g。与正常条件相比，干旱处理导致所有品系的根冠比增加，正常条件下的根冠比为0.271—0.917，而干旱胁迫下其变异范围为0.357—1.512。各个性状均表现出较大的变异，变异系数为0.363—0.760，表明该群体具有丰富的遗传变异和遗传多样性。相关性分析表明，地上部鲜重与地下部鲜重、生物量存在较强的相关性，且表现为正相关，地上部鲜重与根冠比呈显著负相关，地下部鲜重与根冠比存在显著正相关，生物量与根冠比呈显著负相关。其中，地上部鲜重与生物量相关性最高（=0.940）。使用地上部鲜重抗旱系数、地下部鲜重抗旱系数、生物量抗旱系数和根冠比抗旱系数的加权隶属函数值（值）综合评价各个品种的抗旱性，鉴定到5个优异的强抗旱种质，其中品系IR214的值最大，为0.851，其次为IR92、IR213、IR235和IR218等。

2.2 SNP多态性及分布

根据小麦660K SNP芯片的基因分型并进行质控，筛选出可供后续关联分析用的高质量位点319 800个，A、B和D亚基因组上的SNP数目分别为122 213（38.21%）、152 155（47.58%）和37 828（11.83%），其中，A、B亚基因组的多态性基本相同，但D亚基因组的多态性远低于A和B（表1）。21条染色体中，3B染色体上的SNP标记数目最多（40 010个），4D染色体上的SNP标记数目最少（1 954个）。3个染色体组的表现为A（0.374）＞B（0.368）＞D（0.354）。

2.3 群体结构与连锁不平衡分析

基于SNP变异位点的群体结构分析，发现在类群值K=9时，值最小，为0.506，表明参试材料可分成9个类群（图2），其中，亚群3含有71个材料，是最大的类群，亚群4和亚群7材料个数最少，只有2个；
亚群8和亚群9材料个数相近，分别有27和24个，而亚群5和亚群6分别含有13和15个。基于PopLDdecay，对198份小麦材料的LD衰减距离进行计算，发现A、B、D亚基因组的LD区间大小分别为4、5和3 Mb。

A—D：分别为正常条件与干旱胁迫下198份小麦的地上部鲜重（SFW）、地下部鲜重（RSW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）性状的频率分布及比较；
E：干旱胁迫对小麦品种（系）的抑制情况；
F：地上部鲜重、地下部鲜重、生物量和根冠比4个指标的抗旱系数的加权隶属函数值（D值）的频率分布和相关性矩阵。***代表P＜0.001的极显著差异。下同

A：群体分群K值的交叉验证；
B：群体各样品的亲缘关系

表1 SNP标记的分布、物理图谱长度以及其多态性

2.4 干旱胁迫下小麦苗期生物量全基因组关联分析

通过对4个性状指标计算的抗旱系数进行关联分析，共定位到102个与苗期抗旱相关性状显著关联的标记，分布于所有21条染色体上，表型变异解释率（）范围为1.07%—38.70%（表2和图3）。与地上部鲜重显著关联的位点有60个，主要分布于3B、5B、4A、7A等染色体，其中有10个位点分布在3B染色体，范围为1.89%—34.66%；
与地下部鲜重显著关联的位点仅有1个，为15.83%，位于4A染色体；
与生物量显著关联的标记共36个，大部分分布在B亚基因组上（52.8%），其中在5B染色体上分布最多，有7个标记，范围为2.57%—13.78%；
共有5个标记与根冠比显著关联，其中，2个位于5B、3个位于7A，范围为2.23%—10.59%。

2.5 抗旱性相关候选基因的预测与验证

根据上述鉴定的抗旱性显著关联位点，结合亚基因组LD区间及中国春参考基因组注释信息，共预测8 042个候选基因，其中，A亚基因组3 387个，B亚基因组3 229个，D亚基因组1 426个。进一步分析发现，有31个显著位点位于基因内部，包括8个与生物量相关的候选基因，20个与地上部鲜重相关的候选基因，这些基因可作为潜在的重要候选基因（表3）。功能注释发现，它们主要参与跨膜转运、转录调控、蛋白修饰、氧化还原、催化反应等生物学过程。利用公共数据库中小麦干旱胁迫下的根、叶和茎秆的RNA-seq数据，对31个重要候选基因的表达特性进行分析，发现、、和等4个基因，在干旱处理下的根中相比于对照显著差异表达（图4-A），其中，和显著下调表达，而和显著上调表达。预测蛋白结构域，发现含有1个Pyr_redox结构域，含有SCAB等4个保守结构域，仅含有Crr6结构域，含有UPF0261和PEP_hydrolase 2个结构域（图4-B），推测它们可能是参与调控小麦抗旱性的重要候选基因。

表2 苗期抗旱相关性状显著关联的SNP位点及其表型贡献率

SFW：地上部鲜重；
RFW：地下部鲜重；
BIO：生物量；
RSR：根冠比。下同

SFW: Shoot fresh weight; RFW: Root fresh weight; BIO: biomass; RSR: Root-shoot ratio. The same as below

A：地上部鲜重（SFW）、地下部鲜重（RFW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）曼哈顿图；
Un：未知染色体；
B：地上部鲜重（SFW）、地下部鲜重（RFW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）QQ图

表3 抗旱性相关候选基因的预测

最后，对筛选到的4个抗旱性重要候选基因的表达特性进行验证，发现在抗旱品系中表达量呈先降低再升高的趋势，在干旱胁迫6 h时的表达量值最低、48 h时最高，而在敏感品系中，其表达呈现先升高再降低的趋势，在干旱胁迫6 h时表达量最高、48 h时的表达量最高（图5-A）。同时，在干旱胁迫下也显著差异表达，且在抗旱和旱敏感材料表现出相反的表达模式（图5-B），而其他2个候选基因在干旱胁迫差异不显著，暗示和是抗旱性关键候选基因。

A：候选基因的表达量；
DR：干旱处理条件下的根，CR：对照处理条件下的根，DL：干旱处理条件下的叶，CL：对照处理条件下的叶，DC：干旱处理条件下的茎干，CC：对照处理条件下的茎干。B：关键基因的蛋白结构域

2.6 抗旱性关键候选基因的单倍型分析

通过对和2个关键候选基因的单倍型进行分析（图6）。发现这两个基因在供试材料中均存在2种单倍型，但的2个单倍型在4个性状的抗旱系数上均没有显著差异；
而的AX-86174509位点2种基因型在生物量和地上部鲜重抗旱系数上存在显著差异，其中，有112个材料的基因型为C，86个材料的基因型为A，其中A基因型抗旱性显著高于C基因型，是抗旱性相关优异等位变异。

图5 基于qRT-PCR分析的抗旱性关键候选基因的表达模式分析

*代表P＜0.05的显著差异

3.1 小麦苗期抗旱性的鉴定

苗期是小麦生育期中形态和器官建成的关键阶段，小麦苗期形态建成对生长发育后期起重要作用，并最终影响产量，所以苗期被认为是干旱胁迫的关键阶段[20]。干旱胁迫下，植株生物量、叶绿素含量、根冠比均受到了影响[21]。本研究中，198份小麦品系的地上部鲜重、地下部鲜重、生物量含量与正常处理相比均呈下降趋势，表明在PEG渗透胁迫下，小麦为吸收水分使水势降低，营养物质运输到根部减少，进而影响地上部分正常的生长发育，出现生长受阻情况，此时生物量、地上部鲜重、地下部鲜重等下降。在干旱胁迫下，根冠比的干旱系数呈现升高的趋势，可能是在干旱环境中，植物面临水分的限制和胁迫，为了增加水分吸收能力和减少水分蒸散。通过增加根冠比，植物可以增加根系的生长和发育，提高水分吸收能力。根冠比的升高可以帮助植物在干旱条件下更有效地利用有限的水分资源，从而增强其抗旱能力。本研究发现地上部鲜重与地下部鲜重、生物量显著正相关，地上部鲜重与根冠比呈现显著负相关，地下部鲜重与根冠比呈显著正相关，而生物量与根冠比呈现显著负相关，表明这些性状之间可能发挥互促作用，对干旱胁迫下的小麦生长发育产生一定程度的影响。研究发现干旱胁迫诱导大豆幼苗对地上部分生物量的抑制作用增加，进而导致根冠比增加，从而影响生理代谢过程，以抵抗或降低干旱胁迫造成的危害[22]。本研究通过正常和干旱胁迫条件下测定指标的抗旱系数以及各个抗旱系数组成的加权隶属函数值值来评价小麦对干旱的耐受性[23]，可反映不同材料的综合耐性。本研究供试材料存在广泛的表型变异，根据耐受性值，鉴定发掘了IR214、IR92、IR213、IR235和IR218共5个干旱耐受性强的小麦材料，为抗旱小麦遗传改良和种质创新奠定了材料基础。

3.2 小麦苗期抗旱性的全基因组关联分析

随着高通量测序和基因芯片技术的快速发展，全基因组关联分析成为一种快速简便分析复杂性状遗传变异的方法，在动植物中广泛应用[24]。混合线性模型是全基因组关联分析中降低假阳性的最好方法之一[25]。本研究采用MLM混合线性模型对198份供试材料的小麦苗期各干旱性状的抗旱系数进行了全基因组关联分析，共检测到102个与基于不同生物量性状的抗旱系数显著关联的SNP位点，其中49个位点在B亚基因组，40个位点在A亚基因组，剩下的13个在D亚基因组，表明B亚基因组携带了较多的抗旱相关位点。VosS-Fels等[26]利用全基因组关联分析鉴定了多个与小麦地上部和地下部生物量相关位点，其中在5B染色体鉴定到一个主效位点可显著促进根系生长，从而提高了根系生物量。BEYER等[27]通过全基因组关联分析，在1A、2A、3B、5B、6A和7B染色体上鉴定多个与小麦根系生物量显著相关的位点。本研究鉴定发掘的多个位点与前人发掘的根系生物量位点相近，表明本结果的可靠性。此外，鉴定发掘的这些位点既与小麦根部生物量相关，同时也与小麦苗期抗旱性相关，它们可能通过控制小麦根系发育进而参与对干旱的响应[28]，这为进一步挖掘和鉴定同时调控根系发育和抗旱性的多效性基因奠定了基础。

3.3 抗旱候选基因的预测与筛选

本研究通过GWAS分析初步筛选到31个潜在的小麦抗旱性候选基因，基于表达谱数据，进一步筛选出、、和0等 4个重要候选基因。位于1A染色体，是一种二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD），是植物中重要的抗氧化酶之一。研究发现线粒体二氢硫辛酰胺脱氢酶是参与三羧酸循环、光呼吸和支链α酮酸降解的几种多酶系统的组成部分，在拟南芥中过表达可以改善光合作用，进而改善生物量的积累[29]。5B染色体上的是一种肌动蛋白结合蛋白，与细胞膜构成相关，同时可参与调节气孔运动，含有与SCAB1相似的结构域。研究发现气孔闭合相关的肌动蛋白结合蛋白1（stomatal closure-related actin binding protein1，SCAB1）与磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-monophosphate，PI3P）特异性结合，可以通过抑制SCAB1的寡聚化来参与调节拟南芥气孔闭合[30]。在干旱条件下，植物通过调节气孔的开闭来限制蒸腾作用，减少水分的流失，提高水分利用效率来增强抗旱性。位于7B染色体，具有催化酶活性，含有PEP_hydrolase蛋白，参与磷酸烯醇丙酮酸代谢途径。在烟草中研究发现干旱胁迫下烟叶中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶含量显著增加，参与到了烟叶干旱应激反应调节[31]。Caruso等[32]研究了干旱和高温条件下小麦幼苗的蛋白质组变化，发现了12种上调和24种下调蛋白，它们主要参与糖酵解、活性氧去除、氨基酸合成和卡尔文循环。研究表明，抗旱性与小麦中蛋白质的表达之间存在非常密切的关系，研究发现含玉米CPEPC的转基因小麦植株具有更高的抗旱性[33]。含有Crr6蛋白结构域，前人研究发现Crr6蛋白在植物光合作用中起重要作用，通过影响在叶绿体中的组装来影响植物的光合作用[34]。最后，基于qRT-PCR验证结果，证实和是抗旱性关键候选基因，且显著关联位点AX-86174509的2种单倍型在生物量和地上部分鲜重两个性状的抗旱性上存在显著差异，可能是与抗旱性状相关的关键位点，这为进一步深入探究不同基因型对抗旱性的影响及其潜在分子机制奠定了基础。

通过苗期抗旱性鉴定，发掘了5个强抗旱种质。基于660K SNP芯片的全基因关联分析，获得102个与抗旱性状显著关联的SNP位点，预测到31个重要候选基因，它们主要参与转录调控、蛋白修饰、氧化还原等过程，从而调节小麦的抗旱性。结合转录组表达谱分析，筛选到和2个关键候选基因，其中，的2种单倍型在生物量和地上部分鲜重的抗旱系数上存在显著差异，是抗旱性相关功能位点。

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Genome-wide association study of drought tolerance at seedling stage in ICARDA-introduced wheat

ZHANG Ying1, SHI TingRui1, CAO Rui1, PAN WenQiu1, SONG WeiNing1,WANG Li2, NIE XiaoJun1

1College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Agricultural Resources and Environment, Shandong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Nutrient Use and Management, Ji’nan 250100

【Objective】Drought is one of the most destructive environmental stresses limiting wheat production. The novel germplasm with excellent drought tolerance as well as their candidate loci were identified and characterized to enrich the genetic basis of drought tolerance and lay a material foundation for wheat genetic improvement in China. 【Method】In this study, the drought tolerance of 198 wheat accessions introduced from International Dry Area Agriculture Research (ICARDA) were investigated at seedling stage through hydroponic method with PEG6000 simulating drought. Drought tolerance index (DTI) was calculated using the shoot fresh weight, root fresh weight, total biomass and root-shoot ratio, respectively. Genome-wide association analysis was performed using 660K SNP array genotyping to obtain the SNP loci and chromosome regions associating with drought tolerance index. Combined with the expression patterns in root and other tissues, the potential candidate genes were identified, and then they were further verified by qRT-PCR approach with the most drought-tolerant accession IR214 and the most drought-sensitive accession IR36 as materials. Finally, the excellent haplotypes of key candidate genes were analyzed. 【Result】Compared to normal control condition, the growth and development of wheat were significantly impaired under drought treatment. There were also significant phenotypic variations among different accessions with all of the four traits displayed normal distribution. The coefficient of variation ranged from 0.363 to 0.760 with genetic diversity from 0.310 to 0.400. Using the weighted membership function value (value), the drought tolerance of these accessions was evaluated. Results showed that accession IR214 had the highestvalue with 0.851, followed by IR92, IR213, IR235, and IR218, which could be considered as the novel excellent drought-tolerance germplasm. Furthermore, through genome-wide association study (GWAS) analysis, a total of 102 loci were significantly associated with the DTI values based on these four traits, with the phenotypic variation explained value () from 1.07% to 38.70%, of which 60 loci were associated with above-ground fresh weight, 1 locus associated with underground fresh weight, 36 loci associated with biomass and the remaining 5 loci associated with root-shoot ratio. Then, 31 candidate genes were predicated based on genomic annotation information and LD block. Combined with the expression patterns of them in roots and other tissues, 4 candidates displaying differential expression between CK and drought conditions were obtained. Finally, the expression levels of these 4 candidates were further verified by qRT-PCR method with the most drought- tolerant accession IR214 and the most drought-sensitive accession IR36 as materials to obtain two key candidates associating with drought tolerance. Additionally, their haplotype effects were investigated. It was found that the different genotypes of AX-86174509 locus ingene showed significant differences in drought tolerance, which might be considered as a causal locus.【Conclusion】Totally, 102 loci and 2 key candidate genes (and) underlying drought tolerance at seedling stage were detected in ICARDA-introduced wheat, and AX-86174509 inwas a potential functional locus.

wheat; drought stress; 660K SNP array; genome-wide association analysis; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.004

2023-07-12；

2023-09-18

国家自然科学基金（U22A20457）、国家重点研发计划（2021YFD1900190）

张颖，E-mail：yingz99040001@gmail.com。通信作者王利，E-mail：wangli2630000@hotmail.com。通信作者聂小军，E-mail：small@nwsuaf.edu.cn

（责任编辑 李莉）

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