唐丽 李春艳 孟紫微 李亚鹏 张王斌
doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.018
摘 要：【目的】分析新疆生产建设兵团第一师阿拉尔市库尔勒香梨园梨树腐烂病病原菌的种群分类，通过6对保守基因序列，研究库尔勒香梨腐烂病病原菌序列之间相关性及差异性。
【方法】在库尔勒香梨园内采集具有典型症状的腐烂病病样，经科赫氏法则验证获取腐烂病病原菌纯培养。采用CTAB法提取腐烂病病原菌基因组DNA，通过PCR扩增ITS、β-tubulin、EF-1α、ACT、LSU、RBP2基因并测序，利用分子系统学分析不同基因片段的系统发育关系。
【结果】在阿拉尔周边混交园内库尔勒香梨腐烂病菌种为Valsa mali var.pyri（V.ambiens、Valsa mali）。种内差异与地理位置有关，国内与国外梨腐烂病分离株差异较明显。EF-1α、ACT、LSU、RBP2在进化过程中更能够体现种间差异，系统发育树分支多，存在种间差异。
【结论】
新疆生产建设兵团第一师阿拉尔市库尔勒香梨腐烂病病原菌种群分布和种间差异性，库尔勒香梨园的腐烂病病原菌主要为Valsa mali var.pyri、Valsa sordida。
新疆南疆绿洲特色果园种植模式，以杨树等为主防护林最为常见，存在着林果树木腐烂病交叉侵染的可能。
关键词：基因序列；
Valsa mali var.pyri；
Valsa sordida；
分子鉴定
中图分类号：S436.611.1+1 文献标志码：A 文章编号：1001-4330（2024）03-0681-09
收稿日期（Received）：
2023-07-10
基金项目：
国家自然科学基金项目（31660034）
作者简介：
唐丽（1993-），女，四川德阳人，硕士研究生，研究方向为植物病理学，（E-mail）susuzaizai@163.com
通讯作者：
张王斌（1974-），男，陕西澄城人，教授，硕士生导师，研究方向为植物病理學，（E-mail）zwbzky@163.com
0 引 言
【研究意义】库尔勒香梨是新疆阿克苏地区绿洲农业果树的主栽树种之一［1-2］。近年来，新疆阿克苏地区果园梨树腐烂病发生严重，林果树木减产，甚至造成死树或毁园［3-4］。库尔勒香梨的种植以杨树、胡杨、沙枣为防护林树种，不同寄主来源腐烂病菌存在交互侵染现象［5］，因此，研究库尔勒香梨园梨木对腐烂病种间差异性尤为重要。
【前人研究进展】我国依据形态学特征将梨树腐烂病的病原菌鉴定为梨黑腐皮壳菌（Valsa ambiens）［6］。郭开发［7］针对新疆杨树腐烂病、苹果腐烂病、核桃腐烂病等主要经济果树的腐烂病病原菌的ITS、β-tublin进行研究分析鉴定，壳囊孢属真菌寄主专一性弱，易发生寄主“跳跃”现象［8］。因此，仅靠寄主、形态学特征或单基因系统发育研究进行病原菌鉴定并不可靠，多基因联合分析可弥补单基因的片面性，对种间差异所得结果更加准确，多对基因在分离株体内的作用是不同的，基因之间的稳定性也不同，同种分离株之间ITS、BT2种基因相对稳定，突变较少。【本研究切入点】EF-1α、ACT、LSU、RBP2四种基因与ITS、BT分支基本相同，但在树距上仍然存在种内差异，病原菌的鉴定采用多基因分析［9-11］。真核生物核糖体基因转录间隔区ITS［12］（Internal Transcribed Spacer）、β-微管蛋白（β-tublin）、延伸因子1-α（Elongation Factor-1α）、肌动蛋白（Actin）、核糖体大亚基（Ribosomal Large Subunit）、RNA聚合酶第二亚基（the second lar-gest RNA polymerase subunit 2）具有较好的种间变异性和种内稳定性，可以作为用于壳囊孢属快速分子鉴定和DNA条形码的候选基因［13-15］。
【拟解决的关键问题】采集新疆生产建设兵团第一师阿拉尔市香梨园腐烂病带病组织，经过科赫氏法则获取库尔勒香梨园内腐烂病病原菌进行纯培养，通过PCR扩增ITS、LUS核糖体基因和act、rpb2、tef1-a、tub编码蛋白基因，运用分子系统学分析不同基因片段的系统发育关系，研究种内、不同地理来源梨树腐烂病的差异性，以及同一果园内不同寄主上的腐烂病浸染其他果树状况。
1 材料与方法
1.1 材 料
供试标本：从新疆生产建设兵团第一师阿拉尔市周边库尔勒香梨园采集发病枝条、树皮等采集具有明显病征的带病组织，记录标本编号、寄主种类、采集地点等信息带回实验室备用。
表1
1.2 方 法
1.2.1 病原菌分离与纯化
将标本采用组织分离法［16］从病健交界处切取5×5（mm）的病样组织，依次用75%酒精浸泡1 min、0.1%升汞浸泡1 min、无菌水冲洗3次后将3～5块组织块均匀放置于PDA平板中，置于25℃恒温培养箱培养。培养2～3 d后，在无菌操作台下，用接种针在菌落边缘挑取3～5 mm的菌丝块纯培养。将纯化后的菌株回接于寄主的离体枝条上，4 d后进行2次分离纯化，每个分离株3次重复，另一份置于PDA斜面4℃冰箱保存。
1.2.2 菌丝的获得和收集
PDA培养基25℃培养3 d菌株，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，每一供试菌株取3个菌饼，分别放入装有150 mL PD培养基的锥形瓶中，置于25℃，180 r/min摇床内进行培养，待菌丝长满液面取出菌丝，用无菌滤纸干燥处理后，分装于2 mL离心管中，置于-80℃超低温中保存。
1.2.3 DNA的提取
提取基因组DNA采用改良CTAB法［17-18］。
（1）将2.0 mL 离心管中冷冻干燥后的腐烂病菌的菌丝体，用灭过菌的研磨棒快速研磨成粉末状。
（2）向离心管中加入600 μL 的抽提缓冲液（50 m M EDTA，100 m M Tris-HCL（pH 8.0），3% SDS），涡旋混匀。
（3）将离心管放入 65℃的水浴中 1～1.5 h，每隔10 min 轻轻颠倒离心管1次，使得研磨后的粉状菌丝颗粒和抽提缓冲液充分混匀。
（4）向离心管中加入 650 μL 的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，涡旋混匀。并于 4℃，12 000r/min离心 15 min。
（5）取上清液（450 μL）转移至另外一个新的 1.5 mL 离心管中，向其中加入等体积的氯仿并混合均匀，于 4℃，12 000 r/min离心 10 min。
（6）吸取上清液（350 μL）转移至另一新的 1.5 mL 离心管中，向其中加入10 μL 的 3 M Na Ac和 200 μL 的异丙醇，小心的反转离心管将液体混合均匀，室温静置 5 min，即可看到絮状的 DNA 沉淀从溶液中析出。
（7）离心管于4℃，12 000 r/min 离心5 min，小心的将上清液倒出，并将将离心管倒置于干净吸水纸上，使管内液体流净。用500 μL 冷冻保存的 70%乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇冲洗1次，置于室温条件下干燥。
（8）待无水乙醇挥发干净后，向离心管中加入 100 μL TE（pH 8.0），4℃放置过夜使DNA 完全溶解。
（9）DNA 完全溶解后，向其中加入 1 μL 10 mg/mL RNase，37℃水浴 2 h，使RNA完全降解。处理完的DNA溶液经质量检测后（紫外吸光光度计法或琼脂糖凝胶电泳法），于-20℃保存备用。
1.2.4 PCR的扩增及测序
所提取菌株DNA，由上海生工科技股份有限公司进行PCR扩增及测序。PCR扩增引物序列参考文献［19］。表2
1.2.5 不同基因序列比对及系统发育树构建
将各个菌株的不同基因序列提交至NCBI中Blast程序中与Genbank中已知序列进行比对。在MEGA X中进行进化分析［20］，通过最大似然法和Tamura-Nei模型推断［21］，获得对数似然最高（-1 179.51） 数。将Neighbor-Join和BioNJ算法应用于使用Tamura-Nei模型估计的成对距离矩阵，选择具有优越对数似然值的拓扑，自动获得启发式搜索的初始树。
2 结果与分析
2.1 序列比对与系统发育树的构建
研究表明，田间分离株共22株，分别来自5个不同地理位置果园，以库尔勒香梨树为寄主的分离株有13株、杨树3株、苹果2株；
巴梨、砀山梨、红枣、核桃各1株。分离株基因与GenBank中基因的同源性为95.45%～100%，同一寄主来源的腐烂病之间存在细微的差异。不同地点的相同基因也存在差异，但是总体差异性较小。表3
2.2 6种不同基因序列
2.2.1 rDNA-ITS 序列
研究表明，试验中库尔勒香梨腐烂病分离株与阿拉尔市周边地区蔷薇科果树（苹果）腐烂病分离株聚为一支，没有明显差异。与来源我国新疆、陕西梨腐烂病菌株（V.ambiens）同源性最高100%，与来源韩国梨腐烂病分离菌株同根，但分为2支，存在较大种内差异，亲缘关系较远；
与来源我国新疆阿拉尔市周边地区的杨树、红枣腐烂病分离株同根但节点较远，有明显的属内差异。图1
2.2.2 β-tubulin 序列
研究表明，库尔勒香梨腐烂病分离株与阿拉尔市周边梨园中蔷薇科腐烂病分离株聚为一支（苹果、巴梨），与V.ambiens同源性为 100%。与来源陕西、北京梨腐烂病菌株同聚为一支，无差异。与病原菌为Valsa sordida 的杨树、红枣、核桃腐烂病同根，但亲缘关系较远，分为两支，种内差异较大。图2
2.2.3 EF-1α 序列分析
研究表明，库尔勒香梨腐烂病分离株与阿拉尔市周边蔷薇科腐烂病（苹果、巴梨）聚为一支，从同源性 99.67%可以判断其为V.ambiens。与来源北京、陕西、新疆的梨腐烂病对比并无明显差异。与杨树、红枣、核桃腐烂病分离株分聚为两支，且有同根性，但亲缘关系较远，无同源关系。图3
2.2.4 ACT序列分析
研究表明，阿拉尔市周边混交园库尔勒香梨腐烂病分离株与其他蔷薇科（苹果、砀山梨、巴梨）腐烂病分离株聚为一支，与 V.ambiens同源性达到100%。存在种内出现许多分支，但树距较短，具有同源性但也存在差异。与 杨树、红枣腐烂病分离株V.sordida为同根，但是分聚两支，存在同根性但无同源性。圖4
2.2.5 LSU序列分析
研究表明，阿拉尔市周边地区梨树腐烂病分离株聚为两支，JS-KL-4、JY-KL-3聚为一支，其余的与蔷薇科（苹果）腐烂病分离株聚为一支，但树距较短，亲缘关系较近，置信值为74，存在较大种内差异。与V.ambiens同源性99.16%，与来源新疆梨腐烂病分离株为同一种。与来源寄主杨树、核桃树腐烂病同根，但分聚不同支，树距较长，亲缘关系较远，不具有同源性。图5
2.2.6 RBP2序列分析
研究表明，阿拉尔市周边混交园库尔勒香梨腐烂病分离株与蔷薇科（苹果、巴梨）腐烂病分离株聚为一支，同为V.ambiens，且不同分离株之间仍然存在种内差异，出现了新的节点与不同的树距。与来源我国北京的梨腐烂病分离株无明显差异，同源性为98.58%，但与来源美国梨腐烂病分离株差异较大，同根但树距较远无同源性。与来源寄主杨树、红枣、核桃腐烂病分离株同根，但树距较远，亲缘关系较远，没有同源性。图6
3 讨 论
3.1 地理因素影响
我国不同地区梨树腐烂病分离株种内差异较小［22-24］，但与来源美国、韩国等国家梨腐烂病分离株存在较大差异，是由于不同地理位置、不同品种、不同气候等造成的［25］。同时不同菌株之间也存在遗传分化，且这种分化无地理分布的差异，不同寄主和地理分布的同种腐烂病菌也会出现种内遗传分化，以及新物种的演化，这种分化使该类病原真菌更适应新的外界条件［26］。
3.2 混植园交互浸染
郭仲众［27］、周玉霞［28］等通过室内离体枝条接种发现梨树、苹果、核桃、杨树上的腐烂病存在交互浸染。李春艳等［29］、苟巧［30］等将不同寄主来源腐烂病病菌接种田间苹果和枣树枝条发现苹果、香梨、红枣、胡杨、杨树等腐烂病菌存在交互侵染现象。同种壳囊孢属病原真菌可以侵染多种寄主植物。研究蔷薇科寄主植物腐烂病分离株明显聚集为一支，库尔勒香梨腐烂病的发生交互浸染与树木混种有很大关系。库尔勒香梨腐烂病分离株之间国内差异较小且不明显，国内外差异明显。腐烂病菌作为弱寄生病原真菌，多寄主选择更利于真菌的传播和侵染。库尔勒香梨种植模式为典型的绿洲农业，多为混种模式，园内品种繁杂、又以杨树、胡杨、杜梨为防护林，大大增加了库尔勒香梨园内腐烂病的传播几率。
4 结 论
寄主为库尔勒香梨的腐烂病分离株，与蔷薇科腐烂病（砀山梨、巴梨、苹果）基因同源性高达98%，与寄主为杨树、红枣的腐烂病分离株同根，但亲缘关系较远，进化时间较久亲缘关系较远。在阿拉尔市周边混交园内库尔勒香梨腐烂病菌种为Valsa mali var.pyri（V.ambiens、Valsa mali共同稱谓）。种内差异与地理位置有关，国内与国外梨腐烂病分离株差异较明显。ITS、β-tubulin在进化过程中最为稳定，系统发育树分支简单，种内差异极小。EF-1α、ACT、LSU、RBP2在进化过程中更能够体现种间差异，系统发育树分支多，存在种间差异。
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Population structure analysis of pathogen of pear valsa canker
in Aral area of Xinjiang
LI TANG1，LI Chunyan2，MENG Ziwei1，LI Yapeng1，ZHANG Wangbin1
（1.The National Local Joint Engineering Laboratory of High Efficiency and Superior-Quality Cultivation and Fruit Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Tress in Southern Xinjiang/ Key Lab of Xinjiang Production and Construction Corps in Comprehensive Agricultural Pest Management in Southern Xinjiang/ Scientific Observing and Experimental Station of Crops Pests in Aral，Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Tarim University，Aral Xinjiang 843300，China; 2.Xinjiang Applied Vocational and Technical College，Kuitun Xinjiang 833200，China）
Abstract：【Objective】 The purpose of this study is to investigate the population classification and difference by 6 pairs of gene sequences of the pathogens from Aral City，Ist Oivision，Xinjiang Production and Constraction Corps.
【Methods】 Typical disease samples were collected for purified pathogens by Koch postulates.The total DNA of pathogens was extracted following a standard cetyl-trimethyl ammonium bromide（CTAB） method，subsequently，the ITS，β-tubulin，EF-1α，ACT，LSU，and RBP2 genes were conducted by PCR amplification and DNA sequencing.
【Results】 Pathogenic species of korla pear rot in mixed gardens around Alar Valsa mali var.pyri（V.ambiens、Valsa mali ）.Species differences are related ro geographical tocation.There are significant differences in pear rot disease isolates between domestic and foreign and foreign countries.EF-1α、ACT、LSU、RBP2 is more able to reflect interspecific differences， and phylogenetic tree has multiple branches，resulting in interspecific differences.
【Conclusion】 The results showed that Valsa mali var.pyri and Valsa sordida were the main diseases in Korla pear.It was clear that the difference existed between the species and population distribution of canker disease pathogen in Korl pear.The main shelterbelt such as poplar is the most common windbreak in Southern Xinjiang，maybe there is a cross infection of fruit trees and wood trees.
Key words：gene sequence；
Valsa mali var.pyri；
Valsa sordida；
molecular identification
Fund project：National Natural Science Foundation of China（31660034）
Correspondence author：ZHANG Wangbin（1974-），male，from Chengcheng， Shanxi，professor，reaserch filed：
plant pathology，（E-mail）zwbzky@163.com
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