PRRSV,GP4,蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

郭 昊，乌东高娃，赵洪哲，刘春羽，侯丽娜，王凤雪，温永俊

（内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010018）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起，以繁殖障碍和呼吸系统疾病为主，可造成免疫抑制[1-2]。通常伴有胃肠炎样症状，如腹泻和出血，可垂直传播，严重威胁养猪业[3-5]。PRRS最早发现于美洲，1995年左右出现在中国[6]。因其高度遗传和抗原异质性而拥有复杂的致病机制[7-8]。PRRS只感染猪，对于妊娠母猪和仔猪危害极大。PRRSV通过入侵肺泡巨噬细胞转而进入血液和淋巴循环，造成器官损伤及病毒血症[9]。有研究表明，PRRSV通过激活NF-κB信号传导途径来诱导肠炎症细胞因子的释放，导致肠道炎症和粘蛋白的分泌[10]。由于没有针对这种猪病的有效治疗手段，尽管采取各种措施，但该病仍然在全球范围内广泛流行。为有效预防该病，应建立快速准确的诊断方法，科学结合其流行病学及遗传特点制定防控策略，改进研发更加安全有效的疫苗进行免疫接种[11]。

PRRSV属动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，单股正链RNA病毒[12-13]。按照基因型分为欧洲型（PRRSV-1）和北美型（PRRSV-2），两者只有55%～70%的核苷酸和50%～80%的氨基酸相似性[14]。在中国的分离株为Ⅱ型[15]。病毒基因组全长约15.5 kb，包含11个开放阅读框（open reading frame,ORF），编码14个非结构蛋白和7个结构蛋白[16-17]。ORF4编码的结构蛋白GP4参与病毒感染，高度糖基化，带有4个N连接糖基化位点。GP4在Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV中大小分别为187和183个氨基酸，其中Ⅰ型PRRSV的GP4具有位于高度可变区的线性中和表位，诱导针对同源毒株的中和抗体[18]。有研究表明，GP4与靶细胞膜上主要受体的分化簇163（CD163）共定位，以介导内化和分解，其中GP4和GP2a之间的特定相互作用可以作为病毒附着蛋白，负责介导病毒进入易感宿主细胞时与CD163的相互作用[19-20]。GP4还可与GP2和GP3相互作用，嵌合形成多聚蛋白复合体，参与病毒粒子形成[21]。因此GP4蛋白无论是应用于检测、机理研究还是疫苗研发都有着举足轻重的作用。

本研究利用原核表达系统BL21（DE3）截短表达PRRSV GP4蛋白，利用His标签纯化并免疫小鼠，进行单克隆抗体的筛选与制备，验证单克隆抗体的亲和力和特异性，为PRRSV诊断方法的建立、GP4蛋白的后续生物学研究以及PRRSV诊断试剂的研发奠定基础。

1.1 病毒、细胞、质粒及试验动物 猪繁殖与呼吸综合征病毒（NM2021）、BL21（DE3）感受态细胞、Trans5α感受态细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、Marc-145细胞、pET-32a载体均保存于内蒙古农业大学传染病实验室；
SPF Balb/c小鼠购自内蒙古大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase购自NEB公司；
Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit购自OMEGA公司；
6×His标签抗体购自艾美捷科技有限公司；
HRP标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗小鼠IgG购自Abcam公司；
PVDF膜购自北京碧云天生物有限公司；
1 mL Ni纯化柱购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
PierceTMBCA Protein Assay Kit、Pierce Rapid Antibody Isotyping Kit-Mouse试剂盒购自Thermo公司；
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT选择培养基、TritonX-100购自SIGMA公司。

1.3 重组质粒的构建 PRRSV ORF4序列参照JXwn06株（GenBank登录号：EF641008.1），通过生物信息学软件对GP4蛋白跨膜区、信号肽、二级结构、理化性质以及抗原决定簇进行预测，选取优势截短序列送往华大蛋白进行基因优化合成，并引入限制性酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ。合成序列连接到pET-32a表达载体，获得重组质粒pET-32a-ORF4。提取重组质粒进行双酶切鉴定，反应体系（50 μL）为：质粒1 μg，EcoRⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10× NEB Buffer 5 μL，ddH2O至50 μL，酶切产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4 重组蛋白的原核表达及纯化 将鉴定成功的阳性菌液1∶100接种氨苄抗性LB液体培养基中，37℃条件下200 r/min摇床培养OD600值为0.6～0.8，加入0.5 mmol/L的IPTG，16℃过夜诱导。12000 ×g条件下离心10 min，收集诱导表达后菌体。pH8.0的10 mmol/L Tris-HCl溶液重悬沉淀，加入终浓度为1 mmol/L的PMSF，冰上超声破碎菌体，4℃、12 000 ×g条件下15 min，吸出上清液，沉淀用Tris-HCl重悬。上清液和沉淀重悬液中分别加入5× Loading buffer，100℃孵育10 min制备样品，进行SDS-PAGE电泳检测。采用Ni SepharoseTM6 Fast Flow试剂盒纯化成功表达的目的蛋白，参照PierceTMBCA Protein Assay Kit说明书测定纯化蛋白浓度，同时进行SDS-PAGE电泳检测。

1.5 重组蛋白的Western blot鉴定 SDS-PAGE电泳完成后，将SDS-PAGE胶半干转置PVDF膜，5%脱脂乳室温封闭4 h，PBST洗涤3次，每次15 min；
将鼠源抗His标签抗体1∶4000稀释，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，每次15 min；
HRP标记山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀释，室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次15 min；
将ECL显色液1∶1混合，用凝胶成像系统曝光并分析结果。

1.6 杂交瘤细胞的制备与筛选 将纯化后的GP4蛋白按照60 μg/只，与弗氏完全佐剂按照1∶1比例免疫SPF级BALB/c雌性小鼠4只，编号分别为ORF4-1、ORF4-2、ORF4-3、ORF4-4，间隔两周进行3次加强免疫，剂量为30 μg/只，同时换为弗氏不完全佐剂。采小鼠血液分离血清，间接ELISA检测其抗体效价。包被液稀释GP4蛋白至终浓度为2 μg/mL，100 μL/孔，4℃过夜，洗涤3次；
2%脱脂乳37℃孵育2 h，洗涤3次；
一抗血清自200倍稀释度开始2倍梯度稀释，共稀释10次，同时设置阴性与空白对照，37℃孵育1 h，洗涤3次；
HRP标记山羊抗小鼠IgG 1∶20 000稀释，37℃孵育1 h，洗涤3次；
加入终止液，测其吸光值。选取血清滴度高于25 600的小鼠脾脏制备脾细胞，并采用PEG法与SP2/0细胞进行细胞融合试验，融合后细胞于半固体HAT培养基培养，同时采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞进行亚克隆并扩大培养。采用Thermo公司Pierce Rapid Antibody Isotyping Kit-Mouse试剂盒对扩大培养的阳性杂交瘤细胞进行亚类鉴定。

1.7 单克隆抗体的制备与纯化 石蜡油提前一周注射进SPF级BALB/c小鼠腹腔，将鉴定成功培养好的杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，7 d左右收集腹腔明显肿大小鼠的腹水。采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水抗体。参照PierceTMBCA Protein Assay Kit说明书检测抗体 浓度，SDS-PAGE检测抗体纯度。

1.8 单克隆抗体的鉴定 采用间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay, IFA）及Western blot方法鉴定单克隆抗体。将Marc-145细胞培养于96孔板中，待汇合度90%时将本实验室鉴定分离的PRRSV按MOI为1感染Marc-145细胞，感作2 h，换维持液培养48 h后弃上清液，PBS清洗3次，用4%的多聚甲醛4℃固定1 h，PBS清洗3次，每次5 min；
0.3% Triton X-100通透30 min，PBS清洗3次，每次5 min；
5% BSA、37℃封闭1 h；
纯化单克隆抗体1∶100稀释，37℃孵育1 h，PBS清洗5次，每次5 min；
FITC标记山羊抗小鼠IgG 1∶8000稀释，37℃孵育1 h，PBS清洗5次，每次5 min。倒置荧光显微镜下观察结果。

2.1 原核表达质粒的构建 对重组质粒进行双酶切鉴定，结果表明，优化后ORF4片段约为288 bp，与预期相符（图1）。

图1 pET-32a-ORF4 重组质粒双酶切验证Fig.1 Double restriction digestion verif ication of pET-32a-ORF4 recombinant plasmid

2.2 重组蛋白的原核表达与纯化 对破碎后的上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测（图2），结果表明，诱导表达的蛋白大小为30 kDa，与预期相符，且为上清液表达。将蛋白原样、流穿液、及不同浓度咪唑的洗脱液制样，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果（图3），结果表明，在300 mmol/L咪唑洗脱液二次洗脱样品中目的蛋白含量及纯度较高，可以进行小鼠免疫。

图2 GP4 蛋白的原核表达Fig.2 Prokaryotic expression of GP4 protein

图3 GP4 蛋白的纯化Fig.3 Purif ication of GP4 protein

2.3 重组蛋白的Western blot鉴定 将纯化后的目的蛋白电泳后进行Western blot验证，一抗为鼠源抗His标签抗体，二抗为HRP标记山羊抗小鼠IgG，结果表明，目的蛋白与His抗体成功结合，目的条带大小为30 kDa（图4）。

图4 GP4 蛋白的Western blot 验证Fig.4 Western blot verif ication of GP4 protein

2.4 小鼠血清免疫效价的测定 重组蛋白免疫小鼠后，采取小鼠血液分离血清，通过间接ELISA方法测定其效价（图5），结果显示，4只小鼠血清滴度均高于25 600，皆可进行下一步试验。

图5 小鼠血清效价的ELISA 检测Fig.5 ELISA detection of mouse serum titer

2.5 杂交瘤细胞亚类鉴定 采用Thermo公司Pierce Rapid Antibody Isotyping Kit-Mouse试剂盒对扩大培养的杂交瘤细胞进行亚类鉴定，结果显示，共获得4株IgG亚型阳性杂交瘤细胞株（表1），分别为6、21、60、70号，选择70号杂交瘤细胞株进行单克隆抗体的制备，将其命名为Anti-A-ORF4-70。

表1 杂交瘤细胞亚类鉴定Table1 Identif ication of hybridoma cell subclasses

2.6 单克隆抗体的纯化与鉴定 参照PierceTMBCA Protein Assay Kit说明书测定纯化后的小鼠腹水浓度并进行SDS-PAGE检测，结果显示，该抗体浓度纯度高，在约55 kDa和25 kDa处出现条带，分别为重链和轻链（图6）。采用IFA及Western blot方法鉴定Anti-A-ORF4-70。IFA结果显示，单克隆抗体可以与抗原特异性结合（图7）；
Western blot结果显示，单克隆抗体可以与GP4蛋白特异性结合，出现大小为30 kDa的条带（图8）。

图6 Anti-A-ORF4-70 的纯化Fig.6 Purif ication of Anti-A-ORF4-70

图7 Anti-A-ORF4-70 IFA 验证Fig.7 IFA verif ication of Anti-A-ORF4-70

图8 Anti-A-ORF4-70 Western blot 验证Fig.8 Western blot verif ication of Anti-A-ORF4-70

单克隆抗体作为疾病的诊断工具，因其成本低廉，特异性高，拥有广泛的应用前景。GP4蛋白是参与PRRSV致病的主要结构蛋白[22]。作为典型的Ⅰ类跨膜蛋白，GP4在C-末端区域没有包质尾区，N末端的前22 aa包含独特疏水区，因此为了最大化GP4蛋白的表达效率及保证其抗原性，本研究在对GP4基因序列进行生物信息学分析的基础上，采取了截短序列并进行密码子优化。Costers等[23]发现GP4中的中和表位在体外对抗体具有高度敏感的选择性，而其产生的特异性中和抗体可能是PRRSV进化的驱动力[24]，由此本研究所制备的GP4单克隆抗体可为后续中和表位的研究奠定基础。于洁等[25]原核表达并纯化PRRSV N蛋白免疫小鼠，制备获得4株阳性杂交瘤细胞株，均能与PRRSV特异性反应。周艳君等[26]利用PRRSV CH-1a株浓缩的病毒抗原免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，共筛选到16株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株，且都是针对PRRSV的特异性抗体。刘梦莹等[27]利用PRRSV SD53株超离病毒免疫小鼠，采用PRRSV SD53株和真核表达的PRRSV各结构蛋白作为检测抗原，筛选到1株稳定分泌抗SD53株GP4蛋白的杂交瘤细胞株（LM26)，并鉴定出LM26识别的抗原表位，且该抗原表位在美洲型PRRSV中相对保守。Chen等[28]表达并纯化重组GP4蛋白，经过噬菌体展示和筛选，可进行PRRSV与其他病毒的鉴别诊断，同时在筛选噬菌体上展示的外源肽显示出对GP4蛋白的高亲和力，并在体外对PRRSV渗透具有显著的抑制作用。GP4单克隆抗体不仅可以用于抗原的检测，对于PRRSV相关的机理研究也有着重要作用。

本研究将PRRSV ORF4序列合成后克隆入pET-32a原核表达载体，经诱导表达获得了大小为30 kDa的GP4蛋白，该蛋白为可溶表达且表达量高。纯化后免疫小鼠制备单克隆抗体，共筛选出4株阳性杂交瘤细胞株，分别为6、21、60、70号，并选择70号阳性杂交瘤细胞株进行单克隆抗体的制备。IFA及Western blot结果表明，所制备单克隆抗体特异性强，可用于PRRSV的检测及诊断试剂的研制。

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