基于DNA,条形码的棕榈裸蠓雄虫的发现与描述

何泽华，李加慧，林晓丹

（海南大学 植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海口 570228）

棕榈裸蠓Atrichopogonpalmatus隶属于蠓科Ceratopogonidae 铗蠓亚科Forcipomyiinae 裸蠓属Atrichopogon[1]，该种雌虫于1962 年在日本被首次记述[2]，可根据其腹部第7～9 节腹面具有特殊的赘生物进行鉴别。1990 年刘增加等[3]基于甘肃康县的雌虫标本命名新种多刺裸蠓（Atrichopogon sentusYu and Qi, 1990），该种后被Liu 等[4]异名为棕榈裸蠓，但棕榈裸蠓的雄虫迄今仍未发现。经海南岛裸蠓标本整理鉴定发现了棕榈裸蠓的雌虫，形态学鉴定为棕榈裸蠓，并利用DNA 条形码技术对雌、雄个体进行配对，首次发现了棕榈裸蠓雄虫，并对该种进行描述。

研究样本为2020—2021 年于海南岛内采集的所有棕榈裸蠓成虫酒精标本，标本处理参照吴小香的方法[5]，对所有总计12 头标本进行无损形态DNA 提取，DNA 提取参照天根血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒方法，随后制成玻片。

DNA 条形码：以COI（细胞色素C 氧化酶亚基I）基因作为DNA 条形码基因，通用引物为LCO1490: 5′- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG - 3′和HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′，进行PCR 扩增[6]。扩增体系和反应程序参考吴小香的方法[5]并进行了一定的改动，在原25 μL 体系中，DNA 模板由原来的2 μL 增加至3 μL，ddH2O 减少1μL，PCR 反应循环由原来的35 个降至30 个。经测序，最终获得长度为658 bp 序列11 条，目前已在 BOLD （http://www.boldsystems.org/index.php）上公开。选择并下载已公开的5 种裸蠓COI 序列：①稀瘤裸蠓Atrichopogon oedemerarum, GenBank 登录号：KJ767872.1；
②温勒裸蠓Atrichopogon winnertzi,GenBank 登录号：KT278275.1；
③棕色裸蠓Atrichopogon fusculus, GenBank 登录号：HQ945252.1；
④Atrichopogon infuscus, GenBank 登 录 号 ：KJ767868.1；
⑤Atrichopogon hirtidorsum; Gen-Bank 登录号：KT278273.1。利用 MEGA 7.0.14 采用Kimura 双参数模型（Kimura-2-Parameter, K2P）计算种内和种间遗传距离[7]；
选择残脂库蠓Culicoides imicola（GenBank 登录号：KT307823.1）和台湾铗蠓Forcipomyia taiwana（GenBank 登录号：KF528691.1）作为外群，构建系统发育树（phylogenetic tree），并进行自举检验（Bootstrap=2000）。

形态学方法：使用奥林巴斯 SZX16 体视显微镜观察酒精标本，并连接CCD（DP72）对虫体整体轮廓进行拍摄。完成拍摄后，对虫体进行消化裂解，并在福斯德 XPZ-830BI 连续变倍体视显微镜下进行解剖制成玻片标本，最后使用生物显微镜XSP-12CA 和 CCD（YH5001）对玻片标本进行鉴定、测量和拍摄。利用 Adobe Illustrator CC 2018对雄性成虫生殖器进行绘制；
利用 Photoshop 对绘图和照片进行排版。形态术语及测量依据遵循Borkent & Picado 和Felippe-Bauer 的方法，测量数据值在文中的表达形式为最小值至最大值（平均值，n为测量标本数）[8 - 9]。

形态术语缩写如下，触角比（AR）：雄虫触角鞭节10 ～ 13 节总长与1 ～ 9 节总长的比值，雌虫触角鞭节9 ～ 13 节总长与1 ～ 8 节总长的比值；
触须比（PR）：触须第3 节长与其宽的比值；
前缘脉比（CR）：从翅弓脉开始至前缘脉末端总长与从弓脉至翅末端缘总长的比值；
跗节比（TR）：各足第1 跗节与第2 跗节的长度比值，前足跗节比（TRI）、中足跗节比（TRⅡ）、后足跗节比（TRⅢ）。

2.1 棕榈裸蠓雌、雄虫的配对测序获得雄性个体CO I 序列7 条，雌性个体CO I 序列4 条（GenBank 登录号：OQ413720-OQ413730），序列长度为658 bp，该种种内遗传距离为 0.000～0.005，平均遗传距离为0.002，种间遗传距离为0.148～0.206，构建的系统发育树（图1）与图不一致显示测序的所有个体聚为支持率100%的单系，说明雌雄同种，均为棕榈裸蠓。

图1 根据CO I 序列所建裸蠓属系统发育树

2.2 棕榈裸蠓AtrichopogonpalmatusTokunaga,1962 （海南新纪录）Atrichopogon palmatusTokunaga, 1962: 160; Liu et al. 2001: 136; Yu et al.2005: 455[1- 2,4]. 模式产地：日本（冲绳）

Atrichopogon sentusYu e Liut , 1990: （218）;Liu et al. 2001: 136[3-4]. 模式产地：中国（甘肃）

鉴别特征：中小型棕黄色蠓种；
复眼遍布柔毛；
小盾片后缘有粗鬃2 根；
翅面无大毛；
雄虫爪尖分叉，雌虫爪尖无分叉；
雄虫阳基侧突拱桥状，端部1/2 覆有纵皱的膜，顶端有延伸，阳茎中叶基部与阳基侧突基部重合；
雌虫受精囊卵形或椭圆形，第7 腹板中央有1 个棕榈树状突起，第8 腹节腹面有2 对翼状突，第9 腹节两侧各有一长辫状突起。

雄成虫（图2-A）翅长1.02～1.14（1.08，n=6）mm；
翅宽0.38～0.40（0.39，n=6）mm

图2 棕榈裸蠓 Atrichopogon palmatus Tokunaga, 1962 ♂

头：棕黄色（图2-B）。头宽与喙长比为2.22～2.55（2.38，n=7）。两复眼间距与小眼直径近乎相等（图2-C），小眼面间柔毛遍布整个复眼。触角棕色，鞭节2～10 节上着生轮毛；
鞭节第10～13 节延长，第10 节延长程度最低；
第13 节延长程度最高，端突明显，触角比（AR）0.87～1.03（0.95，n=7 ）。触须5 节，棕色，第3 节最长，呈柱状，中部有感觉器窝；
第5 节呈锥状，端钝，触须比（PR）2.42～2.77（2.56，n=7）。

胸：中胸背板棕黄色，鬃毛稀疏，肩部及两侧缘色淡，中间有两条平行淡色带从端部向基部延伸，基部有两个对称淡色斑，呈“八”字；
侧面色淡，侧背片具1 根刚毛；
小盾片黄色，具2 根鬃毛，2～5 根刚毛；
后小盾片较小盾片颜色略深。翅面无大毛分布，中脉叉有柄；
第2 径室长/第1 径室长为1.14～1.81（1.45，n=6）；
CR 0.60～0.62（0.61，n=6）（图2-D）。平衡棒浅棕色。各足均为浅棕色，TRI 3.14～3.84（3.49，n=7）；

TRⅡ 2.91～3.25（3.12，n=7）；
TRⅢ 2.70～2.97（2.85，n=7），后足胫端鬃7～8 根，爪端分叉。

腹：浅棕色。背板颜色较腹板深。尾器（图2-E）：第9 背板后缘弧形，尾须耳状，着生于第9 背板腹面两侧，不超出第9 背板；
第9 腹板后缘两侧与抱握基节衔接处呈弧形浅凹，中间则呈半圆形凹陷，沿中间凹缘有一列弧形排布的鬃毛。抱握基节细长，长于第9 背板，基部内侧有三角形腹踝，与阳基侧突基部接近，踝突短小，呈倒锥状，抱握端节基部2/3 宽而端部1/3 细（图2-F）。阳基侧突拱桥状，表面覆有一层布有纵纹的膜结构，外缘折叠且硬化，端钝且硬化程度略低，上着有一层透明片状结构；
阳茎中叶与阳基侧突基部愈合，腹面近端部有开口，中突指状，背面中部纵向开口。（图2-G）。

雌成虫（图3-A）， 翅长 0.95～1.11（1.01，n=5）mm；
翅宽 0.42～0.47（0.44，n=5）mm。

体型及颜色与雄虫相似。头宽与喙长比为 1.77～2.00（1.90，n=5）（图3-B）。触角棕色，鞭节1～8 节近乎球形，鞭节9～13 节为延长节；
端节末端端突明显，呈剑状，AR 1.62～1.78（1.68，n=5）。触须PR 2.31～2.69（2.56，n=4）。大颚发达，大颚齿11～14 枚。小盾片上的刚毛数为2～7 根。翅较雄虫宽，翅面无大毛；
第2 径室长/第1 径室长为 1.83～2.25（2.13n=5）；
CR 0.65～0.68（0.66n= 5）（图3-C）。各足颜色与雄虫一致，TRI 2.93～3.52 （3.23n=5）；
TRⅡ 3.25～3.59（3.44n=5）；
TRⅢ 2.70～3.19（2.94n=5），后足胫端鬃7～9 根，爪端无分叉。腹部颜色与雄虫相似，受精囊1 个，椭圆形 （0.06～0.09）mm×（0.05～0.06） mm，有颈，基部有刻点（图3-E）。第7 腹板中央有1 个棕榈树状突起，其上有约20 条枝突，第8 腹节腹板有2 对翼状突，靠侧缘的翼状突基部有若干鬃毛，中间的翼状突由4～5 根粗刺由长至短并排组成，第9 腹节两侧各有1 个长辫状突起（图3-D）。

图3 棕榈裸蠓 Atrichopogon palmatus Tokunaga, 1962♀

检视标本：标本7♂4♀来自海南省琼中县黎母山国家森林公园，其中，2♀2♂，黎母山林间（19.1731°N/109.7310°E，H 663 m），为吴小香、何泽华于2020-11-20 灯诱获得，标本编号：Atr143、Atr143-1、Atr146、Atr146-1；
1♂，黎母山村落溪水边（19.1743°N/109.7324°E，H 686 m），为吴小香、何泽华于2020-11-20 灯诱获得，标本编号：Atr31；
1♀，黎母山主峰路口（19.1753°N/109.7427°E，H 647 m），为吴小香、何泽华于2020-11-20 灯诱获得，标本编号：Atr93；
1♀，黎母山（19.1742°N/109.7431°E，H 646 m），为何泽华于2020-11-19 灯诱获得，标本编号：Atr136；
4♂，黎母山森林公园（19.1774°N/109.7427°E，H 686 m），为吴小香、何泽华于2020-11-21 灯诱获得，标本编号：Atr113、Atr113-1、Atr113-2、Atr114。标本1♀来自海南省文昌市八门湾上圮村红树林内（19.4527°N/110.7440°E，H 5 m），为邓斌于2021-11-18 网捕获得，标本编号：Atr221。

国外分布：日本[2]

国内分布：甘肃[3]、海南。

棕榈裸蠓隶属于裸蠓属多赘（Psilokempia）类群[10-11]，雄虫与琴形裸蠓Atrichopogon lyratusYu et Yan, 2005 的尾器形态特征相似[1]，但棕榈裸蠓第9 背板后缘呈弧形、尾须的着生位置以及复眼相离可区别于琴形裸蠓。

棕榈裸蠓雌虫腹部具有特殊的赘生物，而雄虫缺少上述特征，仅通过形态学特征进行雌、雄配对较为困难。基于CO I 条形码，棕榈裸蠓的种内遗传距离为0.000～0.012，符合蠓科种内差异范围0.000～0.040[12-13]，远小于裸蠓种间遗传距离0.148。通过DNA 条形码技术实现了棕榈裸蠓雌、雄个体的配对，首次描述了棕榈裸蠓的雄性个体。

全世界目前已记录裸蠓513 现生种[14]，中国记录92 种[1,15 -20]，而有相当一部分种类是仅有雌虫或雄虫的记录。DNA 条形码技术可以实现不同性别个体配对，有助于加速单性别的裸蠓物种缺失性别的发现。

致谢：感谢吴小香在绘图及排版方面给予帮助。

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