外泌体作为药物载体在中枢神经系统疾病中的研究进展*

邹俊清，丁网丽，胡君雅，黄 欣，张雪萌，**，朱君荣，**

1南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）药学部，南京 210006；
2中国药科大学南京市第一医院 药学部，南京 211198

近几十年来，脑内药物浓度过低一直是中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病药物治疗发展的瓶颈。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在和选择渗透性是制约CNS 药物进入脑内的主要因素[1]。因此很多治疗药难以到达大脑内，最终临床转化治疗均以失败告终。因此，迫切需要有效的药物递送系统（drug delivery system，DDS）来克服BBB 生理障碍，从而提高药物疗效并促进临床转化进程。

目前已经开发的一系列体外合成的脂质体和其他纳米递送系统仍存在一定的局限性，如在体内循环时易被肝和脾网状内皮系统巨噬细胞吞噬，且在生物体液中的半衰期短，穿过BBB 时效率低、稳定性差、靶向性低[2，3]，因此在临床转化时受到阻碍。近年来研究人员将目光转向内源性DDS——外泌体。外泌体起源于两次质膜内陷过程：细胞质膜内陷形成早期内涵体，随后早期内涵体膜继续内陷，形成多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs），MVBs可以与溶酶体融合，导致其内容物酸化降解，也可以在与细胞质膜相融合时将腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）作为外泌体释放到细胞外空间[4，5]。外泌体具有一定的物质转运功能，它具有脂质双层膜，易于携带来自供体细胞的多种生物活性分子（如蛋白质、脂质和核酸），保护其不被降解并最终被输送到受体细胞发挥生物学功能[6，7]。近年来多项研究表明外泌体可能是良好的天然DDS[8]：首先，外泌体具有良好的生物相容性及低免疫原性，特别是当外泌体来自患者自身细胞或某些特定种类的细胞如未成熟的树突细胞及间充质干细胞时，几乎无免疫原性，有利于发挥药效和减少不良反应[9]；
其次，特定的磷脂和功能性膜蛋白使其能够高效地将内含物递送到靶细胞的胞质中，如外泌体可通过膜融合或间隙连接等途径向胞内递送内容物，从而避开内涵体—溶酶体途径，有利于提高递送效率[10]；
此外，体内某些外泌体具有很强的稳定性，可以避免巨噬细胞的吞噬作用，延长化学药物的半衰期[11]；
最重要的是外泌体的脂膜可以帮助穿越天然屏障如BBB，提高CNS 治疗药物脑内生物利用度[12，13]。因此，外泌体作为DDS 特别是作为良好的天然纳米载药系统为靶向治疗CNS 等疾病提供了巨大潜力。本综述将简要介绍外泌体的载药方式和作为脑部递送载体的特性，以及作为核酸、蛋白质和化学药物的递送载体在CNS 疾病中的治疗应用（图1）。

图1 外泌体作为核酸、蛋白质和化学药物的递送载体在CNS 疾病中的治疗应用

理想的载药方法不仅要实现较高的载药效率，还应保留外泌体完整性和药物的功能。目前，在不破坏外泌体膜完整性的情况下将药物有效载入到外泌体中仍是一个巨大挑战。现有的载药方法可分为被动加载和主动加载。

被动方法比较简单，它是基于药物与外泌体或亲代细胞孵育，并进一步分离含有药物的释放外泌体。药物和外泌体直接孵育，操作方法相对简单，但载药效率取决于药物的疏水性。对于一些疏水性小分子，因其能和外泌体膜的脂质层相互作用，故可通过简单孵育的方法完成载药，例如，将外泌体与疏水性姜黄素一起孵育可将姜黄素有效地装载到外泌体中，包载效率为（18%±5%）[14]；
外泌体的被动负载也可将亲代细胞与药物共孵育，使药物进入细胞质，此方法只涉及对细胞的处理，而对提取的外泌体几乎不进行处理，能较好地保留外泌体的完整性和功能性[15]。这种方法主要用于细胞毒性低的小分子化学药物的负载，例如，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和紫杉醇孵育时，能够使其包装进入分泌的外泌体中[16]；
巨噬细胞和姜黄素孵育时，姜黄素可以被包埋在外泌体中，载药效率为14.5%[17]。然而，被动载药的负载效率相对较低。

主动加载方法可以实现更高的加载效率，包括超声、电穿孔、挤压、转染和冻融循环等。HANEY MJ 等[18]为将过氧化氢酶包载到外泌体中，对比了孵育、冻融循环、超声和挤出几种方法，发现不同处理方法的包载效率为：孵育＜冻融循环＜挤出≈超声。此外，KIM MS 等[19]分别使用了孵育、电穿孔及温和的超声法将紫杉醇载入到外泌体中，结果证明超声法载药效率最高。然而，如无适当的实验条件优化，外泌体的完整性可能会受到损害。

表1 总结了各载药方式的优缺点，对于不同的药物，应根据药物的特性选择合适的载药方法，除了考虑载药效率，外泌体膜的完整性和稳定性在药物传递中也很重要。

表1 基于外泌体的药物递送系统的药物加载技术的优缺点

2.1 天然外泌体

外泌体具有基于供体细胞的天然靶向能力，不同细胞来源的天然外泌体可以靶向不同的细胞。外泌体表面配体与大脑内皮细胞受体之间的相互作用被认为是外泌体能够穿越BBB 的主要机制，例如，YUAN D 等[20]发现幼稚巨噬细胞（naive macrophage，Mø）外泌体可以通过外泌体上整合素淋巴细胞功能相关抗原1、细胞间粘附分子1 和脑微血管内皮细胞上的碳水化合物结合性C 型凝集素受体之间的相互作用穿过BBB 进入脑内。此外，QU M 等[21]发现来自血液的外泌体也显示出天然的脑靶向能力，涉及转铁蛋白—转铁蛋白受体相互作用，其能够通过转铁蛋白受体介导的内吞作用穿过BBB；
而QI Y 等[22]发现血浆外泌体可通过外泌体的热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）与脑血管内皮细胞Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）之间的特异性主动靶向穿越血脑屏障。除了通过穿过BBB的方式进入脑组织，GRAPP M 等[23]发现外泌体也可以通过穿越脉络丛中的脑脊液—脑屏障进入大脑，脉络丛上皮细胞产生的外泌体含叶酸受体-α（folate receptor-α，FRα），可以穿过室管膜细胞层并分布到脑实质中，从而被星形胶质细胞和神经元摄取，表达FRα 的外泌体选择性靶向脑实质的特性为脑部药物递送提供了一种新途径。

2.2 工程化外泌体

虽然部分天然外泌体能够靶向大脑，但经静脉注射后，来自骨髓的树突状细胞（dentritic cell，DC）和MSCs 的未修饰外泌体在网状内皮系统器官（如肝脏和脾脏）中快速积累，很少能够被递送至大脑[24，25]。天然外泌体的低特异性靶向能力和尺寸依赖性严重影响细胞对外泌体的摄取[26]，而对外泌体表面进行修饰可以很好地提高其靶向能力。工程化修饰分为供体细胞工程和外泌体工程，前者是通过基因工程和化学方法对供体细胞进行改造，在外泌体生物发生时直接对外泌体进行修饰[27]。例如，狂犬病病毒糖蛋白（rabies viral glycoprotein，RVG）肽能够特异性结合乙酰胆碱受体并在神经内皮细胞和神经元细胞上表达[28]，将RVG 肽序列和编码溶酶体相关膜糖蛋白 2b（lysosomal -associated membrane protein 2b，Lamp2b）构建的质粒引入未成熟DC，RVG 肽与Lamp2b 融合并在DC 衍生的外泌体表面富集，从而产生修饰的RVG-Lamp2b 外泌体，修饰后的外泌体在小鼠体内显示出穿越BBB的能力及良好的靶向效率[9]。外泌体工程则是在适当的条件下，使用特定的技术对纯化的外泌体表面蛋白或内容物进行修饰，例如化学合成的c 肽[cyclo（Arg -Gly -Asp -D -Tyr -Lys）peptide，c（RGDyK）]对整合素αvβ3 具有高亲和力，通过点击化学将其结合到外泌体表面，工程化的c（RGDyK）缀合外泌体能够成功地靶向缺血损伤区域，并在短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠模型的神经元和星形胶质细胞中高度富集[29]。

3.1 缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）

缺血性脑卒中起病急骤并伴随严重的神经功能缺损，约占脑血管病发病的80%[30]。依达拉奉（edaravone，Edv）在临床上主要用于改善IS 脑受损程度，然而，Edv 的半衰期短和生物利用度低导致其治疗效果有限[31，32]。因此，LI F 等[33]开发了含有Edv的巨噬细胞衍生外泌体（Exo+Edv），发现外泌体显著提高了Edv 的脑内生物利用度，与游离Edv 组相比，Exo+Edv 组显示出更高的最高血药浓度（Cmax，0.493 vs 0.824 mg·L-1）和更大的药时曲线下面积（AUC，0.172 vs 0.583 mg·L-1·h），同时半衰期延长（t1/2，3.301 vs 4.842 h）。在外泌体的介导下，更多Edv 到达脑缺血部位并定位于神经元细胞和小胶质细胞，从而减少神经元细胞的死亡，同时促进小胶质细胞从M1 表型向M2 表型转变，增强卒中模型小鼠的神经保护作用。

在IS 药物靶向治疗中，外泌体除了装载神经保护药物外，也可针对卒中可能的致病机制所涉及的通路蛋白进行包载。改善星形胶质线粒体的功能和促进健康的星胶线粒体向神经元的转移可能是减少IS 诱导的神经元损伤的有效治疗方法，其关键蛋白线粒体动力相关蛋白1（dynamin-related protein-1，Drp1）/线粒体分裂蛋白1（fission 1，Fis1）或可作为潜在治疗靶点[34-36]。七肽（heptapeptide，Hep）是一种Drp1/Fis1 肽抑制剂[37]，然而作为一种蛋白质药物存在易被酶降解、循环半衰期短和膜通透性差的问题[38]。LIU W 等[39]制备了载有Hep 的巨噬细胞衍生外泌体（EXO-Hep），发现外泌体能够帮助Hep 穿过BBB，靶向脑缺血部位，并实现Hep 在活化星形胶质细胞中的分布。EXO-Hep 通过抑制星形胶质细胞的线粒体过度分裂，促进健康星形胶质细胞线粒体向神经元转移，从而显著减少tMCAO 小鼠的脑梗死面积并改善其受损神经功能。

3.2 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）

脊髓损伤会造成运动神经元的不可逆丧失，导致运动、感觉功能障碍以及不同程度的瘫痪[40]。磷酸酶和紧张素同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是轴突生长的主要内在障碍之一，抑制PTEN 表达可促进中枢神经再生，为SCI 的治疗提供了新兴治疗策略[41，42]。然而，PTEN 抑制剂如RNA 干扰（RNAi）的递送由于BBB 的存在、核酸酶降解敏感性以及细胞特异性靶向性差而受到阻碍[43]。GUO S 等[44]开发了装载PTEN-siRNA 的MSCs外泌体，通过神经炎症介导的趋化性靶向脊髓损伤区域，对病变区域的神经元具有高亲和力，促进PTEN-siRNA 在脊髓损伤中发挥作用，鼻内给药后SCI 大鼠获得了显著的运动改善、感觉恢复和更快的尿反射恢复，同时伴随着神经炎症和胶质细胞增生减少、轴突再生和血管生成增加以及结构和电生理改善等生物学变化。

自噬在SCI 后的继发性损伤修复中发挥了重要作用[45，46]，白藜芦醇（resveratrol，Res）能够在多 种神经系统疾病中激活自噬[47]，可有效激活脊髓损伤后的自噬和促进神经修复[48]，然而，Res 在脊髓中的药物浓度较低。FAN Y 等[49]将Res 成功加载到小胶质细胞分泌的外泌体（Exo-Res）中，提高了Res 的稳定性并减慢了其降解速率，并增强Res 通过BBB的渗透，从而增加其在CNS 中的浓度。Exo-Res 通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号通路增加自噬诱导并抑制神经元凋亡来改善SCI 大鼠的运动功能。

3.3 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）

阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病，其特征是进行性认知损伤和记忆丧失，是一种病情进展缓慢的脑部疾病[50]。水飞蓟素（silibin，Slb）可在减少淀粉样蛋白-β（amyloid-β，Aβ）聚集和使星形胶质细胞失活方面发挥双重治疗作用，以改善AD 动物模型的行为和认知能力[51]，然而，脑靶向性差和生物利用度低限制了其应用。HUO Q 等[52]将Slb 封装在巨噬细胞衍生的外泌体（Exo-Slb）中，Exo-Slb 进入大脑后，高选择性结合Aβ1-42，并抑制Aβ1-44的聚集；
同时，Exo-Slb 在星形胶质细胞中被内化以抑制激活，并通过调节核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路减轻星形胶质细胞介导的神经元损伤，有效改善了AD 小鼠的认知缺陷。

与水飞蓟素相似，槲皮素（quercetin，Que）在AD 治疗中也面临着一些溶解度差、生物利用度低、难以穿过大脑的问题[53]，Que 能防止tau 蛋白病变，抑制淀粉样蛋白的产生，并诱导与自噬有关的神经保护[54]。QI Y 等[22]开发了负载Que 的血浆外泌体（Exo-Que），血浆外泌体通过HSP70 与TLR4 之间的特异性主动靶向，穿越血脑屏障，促进药物脑迁移，增加了Que 的脑靶向性和生物利用度。与游离Que 相比，EXO-Que 的药代动力学特征显著增强，半衰期延长（Cmax，1.31 vs 2.5 mg·L-1；
t1/2，36.47 vs 89.14 min）。外泌体对AD 小鼠的记忆缺损具有协同神经保护作用，因此与游离Que 相比，Exo-Que 具有更强的抗凋亡作用，更显著地抑制周期蛋白依赖性激酶5 介导的tau 磷酸化和减少不溶性神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）的形成，更好地改善AD 模型的小鼠认知能力。

3.4 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）

帕金森病是第二大最常见的神经退行性疾病，PD 发生的主要原因通常被认为是多巴胺能黑质神经元的丧失，以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即路易小体（Lewy bodies，LBs）[55]。PD 通常通过注射多巴胺来治疗，但由于BBB 的存在，多巴胺未能有效地输送到大脑[56]，因此，需要可直接包裹多巴胺的DDS，使其以最大的生物相容性和最小的毒性有效穿过BBB。QU M 等[21]采用改进的饱和溶液孵育法，通过最大浓度差促进多巴胺被动渗透到血液外泌体中，以提高血液外泌体的载药效率，该方法的载药效率为（15.97%±0.22%）；
同时，利用血液外泌体的大脑靶向能力，多巴胺被有效地输送到大脑，包括纹状体和黑质，大脑中累积的多巴胺浓度为（1.02±0.15）nmol·g-1，是游离多巴胺的15倍。负载多巴胺的外泌体在PD 小鼠模型中显示出更好的疗效，能够改善多巴胺能神经元丢失和PD小鼠的神经行为功能，并且系统毒性更低。

α-synuclein（α-syn）是LBs 的主要成分，α-syn的聚集导致线粒体功能失调，加速氧化应激，并导致多巴胺能神经元的退化[57]，因此，降低α-syn 表达的策略为减缓PD 的进展提供了有希望的治疗途径。虽然反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）可以降低α-syn 的表达，但仍然无法将ASOs安全有效地传递到神经元。YANG J 等[58]利用外泌体开发了一种安全高效的ASOs 递送方法，用骨髓来源的间充质干细胞（hbmMSC）外泌体包载ASO4（Exo-ASO4），研究发现Exo-ASO4 可到达PD 模型小鼠的脑实质，包括皮层、海马区、纹状体和大脑，并明显减少α-syn 的表达并减弱其聚集程度，因此，外泌体包载外源性ASO4 进入脑内显著改善了PD 模型小鼠多巴胺能神经元的退化及运动功能障碍。

外泌体作为人体内源性成分，具有纳米级大小、低免疫原性、先天稳定性、高递送效率和穿过BBB 的能力，与其他DDS 相比具有明显优势。虽然外泌体作为载药系统在CNS 疾病治疗中具有很大潜力，但要想将这一载药系统应用于临床治疗仍存在许多问题，例如目前应用外泌体装载药物的实验技术手段依然有限，天然外泌体的产量较低且易被自身免疫系统清除，通过表面修饰实现外泌体的高效靶向并非易事，需要严格控制反应条件，避免外泌体的聚集和破损。虽然大量实验已证实，多数细胞产生的外泌体均能有效载药，且在一些疾病的治疗中（尤其是肿瘤治疗）效果显著，但针对不同疾病如何选择合适的细胞作为外泌体的来源，如何高效地装载治疗药物仍需要深入研究；
此外，对于不同来源细胞外泌体进入大脑方式是否一致以及进入大脑后药物何时被释放以发挥作用还不够清晰，阐明上述问题将对外泌体介导的脑部药物递送和CNS 疾病的治疗产生重要影响。随着实验技术手段的不断完善以及外泌体大规模生产方式的出现，外泌体作为纳米载药系统将会成为治疗CNS 疾病的一种有效工具。

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