沙眼衣原体质粒编码蛋白3,的致病性及免疫保护性研究

邓晗，程瑞琴，陈土地，宋雅欣，梁银迎，李平露，赵婉星，马璟玥，王惠平，侯淑萍

（1.天津医科大学总医院，天津 300052；
2.天津河西区瑞普眼科医院，天津 300204）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）是一种专性细胞内寄生的革兰阴性致病菌，是性传播疾病的主要原因之一[1]。据估计全球每年有1.27 亿人感染CT，CT 已成为世界性的公共卫生问题[2]。CT 根据主要外膜蛋白（Major outer membrane protein，MOMP）变化分为多种血清型，血清A～C 型可引起沙眼、致盲；
血清D～K 型可引起性传播疾病，并可导致不孕症、异位妊娠和盆腔炎等并发症；
血清L1～L3 可从生殖道扩散至淋巴系统，导致性病性淋巴肉芽肿[3]，其中L2 型进一步被分为L2a、L2b 型，且L2b 型在男性行为者中高度流行[4]。

CT 含有1 个长度约为7.5 kb 的隐性质粒，编码8 个开放阅读框，通常称为质粒编码蛋白1-8（Pgp1-8），不同质粒蛋白在其生命周期和致病机制中发挥不同的作用[5]。Pgp3 是唯一分泌到宿主胞质中的质粒编码蛋白，已被鉴定为CT 感染的关键毒力蛋白之一[6]。Pgp3 是一种稳定的三聚体，通过其M段与人抗菌肽多肽-37（LL-37）结合形成稳定的复合物，从而抑制LL-37 的抗衣原体活性[7]，并利用LL-37 增强其自身的促炎活性发挥致病作用[8]。另外，CT 为了维持其胞内生存周期，通过多种途径来改善宿主细胞的生存状态，其中抑制细胞凋亡是CT 延长宿主细胞寿命的重要策略之一。有研究表明，Pgp3 可通过上调帕金森病蛋白（DJ-1）表达激活细胞外调节蛋白激酶（ERK 1/2）信号通路来抑制宿主细胞凋亡[9]，还可能通过激活核因子相关因子2/醌氧化还原酶（Nrf2/NQO1）信号通路调节氧化应激反应，其诱导的抗氧化作用促进CT 的传染性[10]。Pgp3 是衣原体优势抗原，有研究表明，Pgp3 DNA 疫苗可以抑制D 型CT 感染并且产生免疫保护作用[11]；
重组D 型Pgp3 蛋白疫苗能抑制鼠肺炎衣原体（Chlamydia muridarum，CM）上行感染，减少输卵管积水的发生[12]。

本课题组前期的研究表明，L2 构建株（GFP）Pgp3 蛋白表达水平高于L2 野生株（WT），其余蛋白表达水平差异均无统计学意义。另外L2 型CT 与D型CT 在小鼠体内致病性相似，且L2 型CT 体外更易培养，因此本研究将L2 GFP 作为研究对象，旨在探索内源性Pgp3 的致病性及免疫保护性。

1.1 一般资料

1.1.1 细胞株和菌株 Hela 细胞株和人输卵管上皮细胞株保存于天津市性传播疾病研究所；
L929 细胞株、L929-Pgp3 细胞株（转染Pgp3 的L929 细胞）、L2 GFP、L2 WT 和L2 PF 菌株均由美国德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心钟光明教授提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 兔抗CT 抗体购自美国Bio-Rad 公司；
鼠抗Pgp3mAb 和MOMPmAb 实验室保存；
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白（IgG）和Alexa Fluor 594 标记的山羊抗鼠IgG购自中山金桥公司；
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔IgG 购自美国Abcam 公司；
4’，6-联脒-2’-苯基吲哚（DAPI）及二苯甲亚胺（Hoechest）33258购自北京索莱宝公司；
磷脂结合蛋白标记的藻红蛋白（PE-Annexin V）细胞凋亡试剂盒购自美国BD 公司；
组氨酸标记的Pgp3（His-Pgp3）蛋白购自北京爱必信生物技术有限公司；
胎牛血清及DMEM 细胞培养基购自美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
荧光显微镜购自德国蔡司公司，化学发光成像仪购自美国伯乐公司，流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.1.3 小鼠饲养及实验分组 5～6 周龄雌性无特定病原（SPF）级C3H 小鼠购于北京华阜康生物科技有限公司[质量合格编号：SCXK（京）2019-0008]，饲养于天津瑞普生物技术股份有限公司空港分公司实验动物中心（实验动物许可证号：SYXK2021-0004），按照实验随机分5 组，每组5 只，包括感染组：L2 GFP组、L2 WT 组、L2 PF 组；
攻毒组：L2 GFP 组和L2 WT组。伦理编号：IRB2022-DWFL-129。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及CT 培养 将1×105个/mL Hela细胞、L929 细胞和L929-Pgp3 细胞接种至24 孔板，待细胞生长密度至80%时，弃掉培养基。30 μg/mL的二乙氨乙基葡聚糖（DEAE-D）液处理30 min，换不含血清的DMEM 培养基，将各菌株接种于24孔板，细胞孵箱放置1 h，32 ℃，离心半径为7.6 cm，1 500 r/min 离心1 h，更换含10%胎牛血清和放线菌酮（终浓度为1 μg/mL）的DMEM 培养基，37 ℃孵箱中继续培养。

1.2.2 Pgp3 蛋白表达水平检测 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）测定L2 GFP、WT 和PF 中Pgp3蛋白表达。各菌株按照上述方法感染Hela 细胞，培养24 h 和44 h 时分别收集细胞，4 ℃，离心半径为9.8 cm，10 000 r/min 离心5 min，取上清经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白样品，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入鼠抗Pgp3mAb 和MOMPmAb，4 ℃孵育过夜后，加入HRP 标记的山羊抗鼠IgG，37 ℃下孵育1 h，洗膜显色。

间接免疫荧光法（IFA）检测L2 GFP、WT 和PF菌株中Pgp3 蛋白的表达。各菌株感染Hela 细胞36 h后经预冷的4%多聚甲醛固定，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）室温处理10 min，PBS 洗涤3 次；
用含10%胎牛血清的DMEM 封闭处理1 h；
兔抗CT（1∶2 000 稀释）和鼠抗Pgp3mAb（1∶2 000 稀释）Ⅰ抗37 ℃孵育1 h，PBS 洗涤3 次后加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔IgG（绿色，1∶300 稀释）、Alexa Fluor 594 标记的山羊抗鼠IgG（红色，1∶300 稀释）Ⅱ抗和DAPI 染色，37 ℃避光孵育1 h；
PBS 洗涤3 次，在荧光显微镜下观察Pgp3 表达。

1.2.3 小鼠生殖道L2 感染模型建立 C3H 小鼠在感染前5 d 皮下注射2.5 mg 孕酮，以促进小鼠对CT的易感性，将2×105包涵体形成单位（IFU）的菌株悬浮于10 μL 蔗糖-磷酸-谷氨酸（SPG）缓冲液中，经阴道接种于小鼠下生殖道。每隔3 d 或7 d 用医用拭子收集阴道脱落细胞，每个拭子浸入500 μL 冷蔗糖-磷酸-谷氨酸（SPG）中，玻璃珠涡旋振荡并稀释，接种到单层HeLa 细胞中，经IFA 计算IFU 数量，并以Log10 表示。

1.2.4 细胞凋亡检测 His-Pgp3 刺激人输卵管上皮细胞24 h 后固定细胞，每孔加入200 μL 二苯甲亚胺（Hoechest）33258，避光染色5 min 后用PBS 清洗，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。接种人输卵管上皮细胞的24 孔板，加入不含血清的DMEM 培养基，50 μg/mL 的His-Pgp3 刺激细胞，放入孵箱培养24 h 后胰酶消化收集细胞，加入100 μL 结合缓冲液重悬细胞，调整细胞数为1×105个/mL，取100 μL 细胞悬液转移至流式管中避光加入5 μL PE Annexin V 和5 μL 7-氨基放线菌素（7-ADD），染色15 min 后加入400 μL 1×结合缓冲液，1 h 内流式上机检测凋亡情况。

1.2.5 免疫荧光检测IFU 和细胞核 将拭子收集的小鼠阴道脱落细胞接种至Hela 细胞，36 h 后Hela 细胞经预冷的4%多聚甲醛固定，PBS 洗涤3次，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）室温处理10 min，PBS 洗涤3 次；
用含10%胎牛血清的DMEM 封闭处理1 h；
兔抗CT Ⅰ抗（1∶2 000 稀释）37 ℃孵育1 h，PBS 洗涤3 次后加入FITC 标记山羊抗兔IgG Ⅱ抗（绿色，1∶300 稀释）和DAPI 染色，37 ℃避光孵育1 h；
PBS 洗涤3 次，在荧光显微镜下计数包涵体数量。L929 和L929-Pgp3 细胞感染L2 WT后，按照上述方法分别在30、60 和80 h 固定细胞，计数细胞核和IFU 数量。

1.2.6 内源性Pgp3 免疫保护性检测 以2×105IFU的L2 GFP 和WT 经阴道感染小鼠，每隔3 d 或7 d测定下生殖道IFU 数量。感染50 d 后，以1×106IFU的L2 WT 菌株再次攻毒小鼠，攻毒后在不同时间点评估小鼠下生殖道IFU 数量。

1.3 统计学分析 应用GraphPad Prism 8 软件进行数据分析，符合正态分布的计数资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验，多样本均数间比较采用单因素ANOVA 方法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 L2 GFP Pgp3 表达水平高于L2 WT 和PF L2 GFP、WT、和PF 菌株分别感染Hela 细胞，提取细胞总蛋白做Western blotting 分析，结果显示：在不同时间点，L2 GFP 和WT 均在28 ku（Pgp3）出现条带，L2 PF 则无条带显示，且L2 GFP 菌株Pgp3 蛋白表达水平始终高于L2 WT 菌株，见图1A。L2 GFP、WT和PF 菌株感染Hela 细胞36 h 后荧光染色，结果显示：L2 GFP 比L2 WT 表达更多Pgp3 蛋白而L2 PF无Pgp3 蛋白表达，见图1B，这与Western blotting 结果一致。

图1 不同L2 菌株Pgp3 表达情况

2.2 小鼠下生殖道L2GFP感染力高于WT 和PF 将等量L2 GFP、WT 和PF 经阴道感染C3H/HeJ 小鼠，不同时间点评估各菌株在小鼠下生殖道的生长增殖情况。结果显示：在感染后第3、7、10 和14 天，L2 GFP组生殖道载菌量始终高于L2 WT 和PF 组；
L2 WT和PF 组在下生殖道感染持续时间明显短于L2 GFP组，L2 GFP 组感染时间持续至第35 天，L2 PF 组持续到第10 天，L2 WT 组感染时间持续至第14 天，见图2。

图2 不同时间点小鼠下生殖道感染情况

2.3 Pgp3 抑制宿主细胞凋亡并促进CT 在细胞间播散感染 重组的His-Pgp3 刺激人输卵管上皮细胞24 h，Hoechst 33258 染色，见图3A，及流式细胞术，见图3B，均显示Pgp3 刺激组细胞凋亡率低于空白组（P＜0.05），见图3C；
在荧光显微镜下观察CT 包涵体及宿主细胞核并计数，见图4A，感染后30 h，L929-Pgp3 与L929 细胞中IFU 数量差异无统计学意义；
感染后60 h 和80 h，L929-Pgp3 细胞中IFU高于L929 细胞中包涵体数量（P＜0.05，P＜0.01），见图4B，且在L929-Pgp3 细胞中CT 形成子代感染并产生较大菌斑；
感染后80 h，L929-Pgp3 细胞中宿主细胞消亡数量显著低于L929 细胞（P＜0.000 1），见图4C。表明外源性和内源性Pgp3 均可抑制宿主细胞凋亡且内源性Pgp3 可促进CT 在细胞间的播散感染。

图3 外源性Pgp3 刺激细胞凋亡情况

图4 L2 WT 菌株感染L929 和L929-Pgp3 细胞情况

2.4 内源性Pgp3 蛋白免疫保护性评估 小鼠感染L2 GFP 和WT 50 d 后，经L2 WT 攻毒，攻毒后第3 天，L2 GFP 组小鼠生殖道IFU 数量显著低于L2 WT 组，且L2 GFP 组感染周期明显短于L2 WT 组，L2 GFP组仅在第3 天培养阳性，而L2 WT 组感染持续至第14 天，见图5。

图5 再次攻毒后不同时间点小鼠下生殖道感染情况

L2 GFP 菌株是将重组的GFP 标记的质粒转化到L2 PF 菌株，理论上，除表达绿色荧光外，L2 GFP与L2 WT 差异无统计学意义。但课题组前期研究显示，L2 GFP 中Pgp3 蛋白表达水平高于L2 WT，但其他质粒编码蛋白表达水平差异均无统计学意义[13]。

CT 感染往往倾向于持续性，且Pgp3 在CT 持续感染中发挥至关重要的作用[14]；
PF[15]以及Pgp3 无效突变株[16]在小鼠生殖道感染模型中均表现出减弱的感染能力，且诱导输卵管积水以及炎性浸润的能力高度减弱，这与笔者的研究结果相似，L2 GFP 菌株因表达更多Pgp3 在小鼠下生殖道持续感染时间显著长于其他菌株。CT 为在宿主体内持续感染，必须调节细胞凋亡。因此，CT 可通过多种机制抑制宿主凋亡，如可能通过激活磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDPK1-MYC）和增强己糖激酶Ⅱ的线粒体结合[17]以及可能通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（MAPK/ERK）生存途径诱导抗凋亡蛋白基因（Bag-1）[18]来抑制宿主细胞凋亡。Pgp3 作为CT持续感染的重要毒力因子也有抑制宿主细胞凋亡作用，已有研究表明Pgp3 可能通过磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶（PI3K-AKT）介导的鼠双微体基因2-p53（MDM2-p53）轴[19]以及可能通过增强抗凋亡蛋白（Bcl-2）降低胱天蛋白酶-3（Caspase-3）和促凋亡蛋白（Bax）的表达来抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的细胞凋亡[20]。为研究Pgp3 抗凋亡作用，本研究将重组Pgp3 体外刺激人输卵管上皮细胞，结果显示干预组细胞凋亡率显著低于对照组；
进一步选用稳定转染Pgp3 的L929 细胞，在感染L2 WT 80 h后，笔者认为L929-Pgp3 细胞消亡数量显著低于对照组，说明外源性Pgp3 和内源性Pgp3 均可抑制宿主细胞凋亡。

Pgp3 在宿主体内有促进衣原体播散感染的作用。衣原体可从下生殖道通过宫颈屏障进入子宫内膜腔，再通过子宫输卵管连接处进入输卵管，诱导输卵管积水，因此上行感染输卵管需要衣原体通过细胞裂解从一个细胞扩散到另一个细胞[21]。有研究显示Pgp3 缺失的CM 株不能从生殖道播散到胃肠道[22]。课题组前期的研究表明Pgp3 在体外可以促进巨噬细胞和树突状细胞的吞噬功能，这可能有助于CT 在宿主体内的播散感染[23]。本研究显示在感染L2 WT 的L929-Pgp3 细胞中，CT 包涵体数量显著高于L929 细胞组，且在感染后期形成较大的菌斑，提示内源性Pgp3 可促进CT 在细胞间播散感染。

CT 有许多免疫性蛋白，如多态膜蛋白（Pmps）、MOMP 和衣原体蛋白酶样活性因子（CPAF），均被选为优势抗原[24-26]。目前CT 疫苗研究大多数集中在CT MOMP 上，但有研究表明单独使用MOMP 应用于衣原体感染的动物模型中，效果欠佳，需要有效的载体传递系统或者高效的佐剂来辅助免疫应答[27]。Pgp3 是CT 一种分泌型蛋白，有良好的免疫原性[28]，已有研究表明小鼠接种重组的Pgp3 蛋白，其血清可产生针对Pgp3 的特异性IgG 抗体，以及辅助型T细胞1（Th1）免疫反应，如产生干扰素-γ（IFN-γ）[12]。有研究表明，使用鼠衣原体WT 免疫小鼠，56 d 后WT 再次攻毒小鼠生殖道，发现WT 可诱导小鼠生殖道产生免疫保护作用，且衣原体感染周期较前缩短[29]。为了探究内源性Pgp3 的免疫保护作用，本研究用L2 WT 攻毒小鼠，发现L2 GFP 组小鼠生殖道衣原体的载菌量比L2 WT 组的载菌量低，且L2 GFP 组感染周期比L2 WT 组感染周期更短，提示内源性的Pgp3 可诱发较好的免疫保护作用。因此内源性Pgp3 是否可作为潜在疫苗的研究对象呢？在之后的小鼠感染模型中，应进一步检测小鼠血清的抗体水平及各种细胞因子水平，明确内源性Pgp3是如何产生免疫保护机制，为衣原体的疫苗研发提供更坚实的基础。另外，Pgp3 可以促进CT 的传播，造成CT 的持续感染，那么Pgp3 在小鼠体内通过何种途径促进CT 的感染呢？在之后的研究中，不仅要评估小鼠下生殖道的衣原体载量，还要评估输卵管的衣原体载量及其病理变化，进一步阐明Pgp3 促进CT 感染的致病机制，为衣原体疾病的预防及治疗提供新的思路和策略。

综上所述，本研究探索了CT Pgp3 的致病性及免疫保护性，通过研究确定了Pgp3 抑制宿主凋亡及促进CT 在细胞间播散感染，且内源性Pgp3 蛋白有良好的免疫保护性。

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