western转膜

下面是小编为大家整理的western转膜,供大家参考。

　western blot 转移电泳一般操作流程

　总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。

　合适的电压/ 电流条件对于电转的成败是非常重要的。

　电转缓冲液和电转条件的选择

　对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的 Bio-rad小型 Mini Trans-Blot 转印槽（湿转）和 Trans-Blot 半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：

　 槽式转印

　半干转印

　 Mini Trans- -t Blot 槽 Trans- -t Blot 半干转印系统转印槽 印迹区域（宽

　x 长）

　10 x 7.5 厘米 24 x 16 厘米 转移参数

　凝胶夹数 2 -

　缓冲液要求 450ml ≤200 ml 电极距离 4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度）

　60 分钟 15–60 分钟 冷却 蓝胶冷却装置/冷却旋管 - 凝胶容量

　18.3 x 19.3 厘米 - 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）

　16 x 20 厘米 - 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）

　16 x 16 厘米 - 13.3 x 8.7 厘米 - 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米 每个凝胶夹 1 块凝胶共 2 个凝胶夹（两种尺寸）

　4 个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米

　 通常我们在做湿转的时候，选择 100V 恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在 120-350mA 之间，分子量在 60KD 以下的 60 分钟即可，分子量在 60KD以上的需要延长转膜时间 60-150 分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如 GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用 3 次，之后电流会过大，不适合再使用。

　 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的 3 倍：3 mA/cm2）

　之间一般 60 分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。

　需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用

　丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。

　具体的对于电压/ 电流的选择，可以参照下表。但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。

　SDS- - PAGE Gels (Towbin Buffer)

　低强度 高强度 Mini Trans-Blot 槽

　30 V/90 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 60 min Trans-Blot 半干转印系统转印槽 N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2 , 10–30 min Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2 , 30–60 min Isoelectric

　Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid- - Urea Gels (0.7% acetic

　acid)

　低强度 高强度 Mini Trans-Blot 槽

　30 V/10 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 1 hr Trans-Blot 半干转印系统转印槽 N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2 , 10–30 min Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2 , 30–60 min