基于UPLC指纹图谱和化学计量学评价不同产地青蒿药材质量

吕渭升 ，李振雨 ，侯栩轩 ，杨小龙 ，卢晓莹 ，孙冬梅， ，陈向东 ，邓淙友

1.广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244；
2.江西一方天江药业有限公司，江西 南昌 330006

青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，始载于《五十二病方》[1]，具有清透虚热、凉血除蒸、解暑、截疟功效[2]。青蒿主要化学成分包括黄酮类、香豆素类、萜类、苯丙酸类及挥发油等，主要有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常等药理作用[3-5]，临床多用于治疗疟疾、登革热、慢性气管炎[6-7]。青蒿生于旷野、山坡、路边、河岸等处，广泛分布于我国南北各地，尤以河南、广西、广东、重庆等地区产量较为集中[8]。

指纹图谱从整体上对中药进行研究，能够较全面反映中药所含的复杂成分及相互关系，是符合中药特点的质量控制模式之一。目前中药指纹图谱广泛应用于中药质量评价的各环节，包括产地加工、采收时间、炮制加工等。随着现代分析技术的发展，所获得的色谱指纹图谱越来越复杂，其通常包涵大量多维的信息和数据，导致有效提取指纹图谱更加困难。化学计量学将多种数据分析方法如主成分分析、聚类分析和回归分析等相结合，对多维、庞大、分散的数据进行筛选和提取，发掘数据间的定性、定量关系，解读数据中蕴藏的意义，为全面深入控制中药质量提供了有力保障。目前，指纹图谱与关键成分定量相结合的中药质量评价方法已成功应用于多种中药，包括厚朴[9]、天麻[10]、蒲公英[11]等，但有关青蒿的研究相对较少。本研究对15批不同产地的青蒿药材建立其UPLC指纹图谱，同时对3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和东莨菪内酯进行含量测定，在此基础上结合聚类分析、主成分分析（PCA）等化学计量学方法评价不同产地青蒿药材质量，为全面、客观、准确评价青蒿药材质量提供依据。

Waters H-Class超高效液相色谱仪（美国沃特世公司），Scientific Q-Exactive Obitriap MS四极杆-静电轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞公司），ME204E万分之一天平（梅特勒-托利多公司），XP26百万分之一天平（梅特勒-托利多公司），JJ600百分之一天平（常熟市双杰测试仪器厂），KQ500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HWS28恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），Milli-Q级超纯水系统（德国默克股份有限公司）。

液相用甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸、甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）为色谱级，其余试剂为分析纯。新绿原酸（批号wkq18030107，含量98%），四川省维克奇生物科技有限公司；
隐绿原酸（批号905-99-7，含量98%）、1-咖啡酰奎宁酸（批号18033004，含量99.9%），成都普菲德生物科技有限公司；
夏佛塔苷（批号51938-32-0，含量95.60%）、东莨菪内酯（批号110768-200504，含量100%）、绿原酸（批号110753-201817，含量96.8%）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号111782-201706，含量97.3%），中国食品药品检定研究院；
东莨菪碱（批号DST210115-056，含量98%，成都乐美天医药科技有限公司）；
3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸甲酯（批号CFN90856，含量98%，Chem Face）。15批青蒿药材经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定，为菊科植物黄花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，符合2020年版《中华人民共和国药典》青蒿药材项下规定，药材来源见表1。

表1 15批青蒿药材样品来源信息

2.1 色谱条件

采用Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；
流动相为甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），质谱分析时B为0.4%甲酸溶液；
梯度洗脱（0～5 min，12%～15%A；
5～10 min，15%～20%A；
10～12 min，20%A；
12～15 min，20%～25%A；
15～35 min，25%～38%A；
35～55 min，38%～65%A）；
流速0.25 mL/min；
检测波长350 nm；
柱温25 ℃；
进样量2 μL。

2.2 对照品溶液制备

取绿原酸对照品、东莨菪内酯对照品适量，加30%甲醇制成每1 mL含绿原酸50 μg、东莨菪内酯35 μg的混合溶液。

2.3 供试品溶液制备

取青蒿药材粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用30%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

取青蒿药材（S10）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定指纹图谱，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照峰S，计算各共有指纹峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一批次的青蒿药材（S10）粉末共6份，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别进样测定，分别测定6份样品指纹图谱，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照峰S，计算各共有指纹峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取青蒿药材（S10）供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，测定指纹图谱，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照峰S，计算各共有指纹峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立及共有峰标定

取15批青蒿药材样品，按“2.3”项下方法制备15份供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各样品指纹图谱，并导出指纹图谱CDF格式文件，将15批青蒿药材指纹图谱导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，以样品S1的指纹图谱为参照图谱，进行保留时间校正和全峰匹配，15批青蒿药材指纹图谱共标识出22个共有指纹峰，以平均数法生成青蒿药材对照指纹图。15批青蒿药材指纹图谱叠加图见图1，青蒿药材对照指纹图谱见图2。

图1 15批青蒿药材UPLC指纹图谱

图2 青蒿药材对照指纹图谱

2.6 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）计算15批青蒿药材指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果见表2。15批样品中有12批相似度均在0.9以上，相似度最高的3批为重庆产区样品；
其余3批样品相似度低于0.9，分别为S8（广西玉林）、S9（广西玉林）和S15（河南驻马店）。

表2 15批青蒿药材指纹图谱相似度评价

2.7 共有峰指认

通过对照品液相色谱保留时间比对及质谱精确分子量、碎片离子对比分析，对22个共有峰进行指认。质谱条件：采用加热电喷雾离子源（HESI），喷雾电压3.24 kV，正、负离子模式，扫描范围100～1 500 m/z，鞘气流速35 Arb，辅助气流速10 Arb，毛细管温度350 ℃，辅助器加热温度350 ℃，一级扫描分辨率70 000 FWHM，二级扫描分辨率17 500 FWHM，二级碰撞能量40 eV；
S-lens电压50 V。青蒿药材正、负离子模式下总离子流图及320 nm色谱图见图3。

图3 青蒿药材色谱图

采用Compound Discoverer 2.1质谱分析软件对目标色谱峰的一级和二级质谱进行解析，确定目标成分的精确分子量、质量数偏差及加合物离子信息，通过与mzCloud标准数据库下碰撞能量为40 eV的二级质谱数据库进行比对，共指认出10个峰，分别为1-咖啡酰奎宁酸（峰1）、新绿原酸（峰2）、东莨菪碱（峰3）、绿原酸（峰4）、隐绿原酸（峰5）、3-O-阿魏酰奎尼酸（峰6）、东莨菪内酯（峰7）、夏佛塔苷（峰10）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（峰12）、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸甲酯（峰15）10个成分，化合物信息见表3。

表3 青蒿药材化合物质谱指认

2.8 含量测定方法学考察

2.8.1 线性关系考察

精密称取3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品17.513 mg，置20 mL量瓶中，加30%甲醇制成每1 mL含852.01 μg的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液5、2、1、0.5、0.2、0.1 mL，分别置10 mL容量瓶中，加30%甲醇至刻度，制成每1 mL含3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸426.00、170.40、85.20、42.60、17.040、8.52 μg的对照品溶液。精密称取东莨菪内酯对照品2.019 mg，置25 mL量瓶中，加30%甲醇制成每1 mL含80.76 μg的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液，按倍比稀释法，依次制成每1 mL含东莨菪内酯40.38、20.19、10.10、5.05、2.53、1.27 μg的对照品溶液。分别取上述不同浓度对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的回归方程为：Y=18 823.57X+8 248.59，R2=0.999 9，表明在8.52～852.01 μg/mL范围内，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸浓度与峰面积线性关系良好。东莨菪内酯的回归方程为：Y=38 439.11X+16 476.81，R2=0.999 9，表明在2.53～80.76 μg/mL范围内，东莨菪内酯浓度与峰面积线性关系良好。

2.8.2 精密度试验

取青蒿药材（S10）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和东莨菪内酯的峰面积RSD分别为0.47%和1.25%，均小于3.0%，表明该方法精密度良好。

2.8.3 稳定性试验

取青蒿药材（S10）供试品溶液，分别在2、4、8、10、12、24 h进样测定，计算3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和东莨菪内酯的峰面积RSD分别为0.23%和1.41%，均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8.4 重复性试验

取同一份青蒿药材（S10）粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，平行6份，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，外标法分别计算3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和东莨菪内酯的含量为3.425 mg/g和0.620 ng/g，RSD分别为1.36%和2.10%，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.8.5 加样回收率试验

取青蒿药材（S10）粉末约0.25 g，精密称定，平行3组，每组3份，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入对照品，按“2.3”项下方法制备9份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果显示，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸回收率为95.52%，东莨菪内酯回收率为96.15%。根据2020年版《中华人民共和国药典》“药品质量标准分析方法学验证指导原则”规定，样品中待测成分含量在0.1%～1%范围时，回收率限度为92%～105%。表明2种成分回收率良好。

2.9 化学计量学分析

2.9.1 主成分分析

PCA通过数据降维，样品分布散点图能够直观呈现样品之间的距离。以22个共有指纹峰的峰面积为变量，采用PCA对15批青蒿药材进行分析，通过SIMCA14.1软件对归一化后的数据进行多变量统计分析，建立PCA模型。结果显示所有样本均在95%置信区间内，模型解释率参数R2X=0.958，预测能力参数Q2=0.561，表明提取的主成分可以解释95.8%的原始变量，模型预测能力为56.1%。15批青蒿药材样品的PCA得分图见图4A，15批青蒿药材主要分为两类，重庆产地为一类，其他产地为一类。不同产地药材差异较大，其中重庆3批药材较为聚集，表明重庆产地药材差异较小，河南产地6批药材与广东、广西产地药材较为聚集。PCA各特征峰变量载荷结果见图4B，根据变量离原点的距离判断变量对主成分的影响权重，距离原点越远表示变量对主成分的影响权重越大。可以看出，分析变量对主成分1的影响权重大小依次为峰12、峰11，变量对主成分2的影响权重大小依次为峰9、峰8、峰15，这5个特征峰是PCA中有效体现不同产地青蒿样品差异的强特征峰。

图4 不同产地青蒿PCA得分图和变量载荷图

2.9.2 正交偏最小二乘判别分析

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）可以将原始数据的差异划分为两部分，一部分与Y变量相关，另一部分与Y不相关即正交垂直的差异。与PLS-DA相比，其能够过滤掉更多的不相关信息，提高模型的预测能力及有效性。为进一步寻找不同产地的差异代谢物，以15批青蒿药材的22个共有指纹峰的峰面积为变量，使用OPLS-DA模型验证各组分离情况，R2Y和Q2分别代表模型可解释的变量和可预测度，可对模型的优劣进行判别。模型R2X=0.996，R2Y=0.999，Q2=0.833。重庆产地和其他产地青蒿药材OPLS-DA得分图见图5。可以看出，重庆产地与其他产地药材显著分离，表明二者差异较大。

图5 不同产地青蒿药材OPLS-DA模型得分图

变量重要性投影（VIP）在OPLS-DA中用于评价变量对分类的贡献程度，可根据VIP值确定潜在的生物标志物，有助于发现具有识别能力的重要变量。一般将VIP>1和P<0.05作为差异代谢物。不同产地青蒿药材VIP见图6。VIP>1的代谢物共有10个，分别是峰11（VIP=1.42）、峰16（VIP=1.45）、峰4（VIP=1.25）、峰12（VIP=1.25）、峰6（VIP=1.24）、峰20（VIP=1.23）、峰22（VIP=1.20）、峰7（VIP=1.12）、峰3（VIP=1.09）、峰5（VIP=1.07）。

图6 不同产地青蒿药材VIP

2.9.3 2种差异代谢物含量测定

OPLS-DA确定的10个差异代谢物中，峰3、4、5、6、7、12经质谱指认，可分为两类：东莨菪内酯和东莨菪碱属于香豆素类成分，绿原酸、隐绿原酸、3-O-阿魏酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸属于苯丙酸类。为进一步明确不同产地青蒿药材质量差异，选择东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸进行含量测定。

取15批青蒿药材粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，采用外标法计算各批样品东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量，结果见表4。15批青蒿药材样品东莨菪内酯的含量为0.207～1.186 mg/g，均值为0.494 mg/g；
3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量为1.028～5.875 mg/g，均值为3.19 mg/g。

表4 15批青蒿药材东莨菪内酯和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量测定结果（mg/g）

不同产地青蒿药材东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量比较见图7。可以看出，不同产地样品2种成分含量差异较明显，其中重庆产地样品东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量均高于其他3个产地，河南产地样品2种成分含量均较低。

图7 不同产地青蒿药材东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量比较

本研究对供试品溶液制备方法进行了考察，包括提取溶剂、提取方式、提取时间及提取溶剂用量，最终确定样品最佳前处理方法。提取溶剂分别考察了甲醇、70%甲醇、30%甲醇、10%甲醇、乙醇、水，结果显示，不同提取溶剂对青蒿药材特征峰影响较大，以70%甲醇和30%甲醇为提取溶剂时总峰面积/称样量较大，而30%甲醇的峰型及分离效果最佳，最终选择30%甲醇为提取溶剂。试验比较了超声与回流2种提取方式，结果显示，2种提取方式各特征峰的峰型及分离效果无明显差别，但加热回流时总峰面积/称样量高于超声处理，因此选择加热回流作为青蒿药材特征图谱的提取方式。此外，对3种不同超声时间以及3种料液比进行了考察，结果显示，以总峰面积/称样量为指标，不同提取时间对青蒿药材特征图谱影响并不大，为保证提取完全，选择加热回流60 min。提取溶剂用量为50 mL以上时，总峰面积/称样量×溶剂用量无明显变化，说明50 mL已提取完全，最终选择50 mL为提取溶剂用量。

本研究基于指纹图谱对4个产地15批青蒿药材进行分析，共确定了22个共有峰，进一步基于UPLC-MS技术对其中峰形好、分离度大的部分指纹峰进行指认，共指认了10种化合物，主要包括1-咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、东莨菪碱、绿原酸、隐绿原酸、3-O-阿魏酰奎尼酸等。相似度评价结果进一步分析可知，12批药材的相似度>0.9，表明所建立的指纹图谱有效可行，基于UPLC技术建立的青蒿指纹图谱能够相对全面地表征青蒿药材中的化学成分，同时能有效区分和评价不同产地青蒿药材。相似度评价结果显示，不同产地的青蒿药材质量存在一定差异，其中3批重庆产区样品整体相似度较高。

为进一步探究不同产地青蒿药材成分差异，采用PCA及OPLS-DA对15批青蒿药材进行分析。PCA结果显示，15批青蒿药材差异较大，主要分为两类，其中重庆产地为一类，其余产地为一类，表明重庆产地青蒿药材与其他产地质量差异较大。

通过OPLS-DA确定了10种差异代谢物，为进一步探讨不同产地青蒿药材质量差异，在指纹图谱基础上增加对香豆素类和苯丙酸类成分含量测定。东莨菪内酯为香豆素类成分，具有抗菌消炎、祛痰止咳作用，对正常动物体温及大肠杆菌内毒素致热动物体温有显著的降低作用[12]，具有较强的水溶性和稳定性[13]，能够反映青蒿发挥传统功效“清热解暑、除蒸”的药理活性，被视为青蒿的有效成分之一。药理研究表明，东莨菪内酯在抗炎、抗肿瘤、降压等方面有很好的疗效[14]。咖啡酰奎宁酸类化合物是植物体内重要的次生代谢产物，具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、调节血糖、血脂、血压及保肝等多种生物活性[15]。对咖啡酰奎宁酸类成分进行药理活性比较发现，综合抗氧化活性，抗炎活性，抗菌、抗病毒作用，细胞保护作用，免疫调节作用，抗高血糖、高血脂作用，抗癌活性7个方面，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸明显优于其他3个苯丙酸成分[16]，测定其含量代表苯丙酸类成分含量，具有一定的参考意义。3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为有机酸类成分，有报道咖啡酰奎尼酸衍生物具有抗炎、抗氧化、抗病毒等活性，可协同东莨菪内酯发挥抗风湿作用[17-18]。因此，选择东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸进行含量测定。结果表明，重庆产地青蒿药材2种差异代谢物的含量均高于其他3个产地，初步表明东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸可能作为区分重庆产地和其他产地的生物标志物。但从产地质量精准性评价角度而言，需要扩大种质资源，增加不同采收期的比较分析来进一步探索。

综上所述，本研究建立的指纹图谱能有效区分不同产地青蒿药材，建立的东莨菪内酯和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量测定方法丰富了青蒿中除青蒿素、山柰素外其他有效成分研究的内容。然而，本研究仅初步探究了不同产地青蒿药材的差异性，今后将结合非靶向代谢组学和靶向代谢组学对青蒿整体代谢物进行研究，同时结合基因组学、蛋白组学等多组学平台探究不同产地青蒿药材质量差异的机制。

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