补肾安胎冲剂含药血清对复发性流产小鼠胎盘滋养细胞功能、血管内皮生长因子及其受体表达的影响

侯阿美 ，王肖莉 ，张意林 ，刘敏 ，梁雪宝 ，储继军

1.安徽中医药大学 安徽 合肥 230038；

2.安徽中医药大学第一附属医院 安徽 合肥 230031

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠早中期连续发生≥3次的自然流产[1]。近年来RSA发病率呈增长趋势，约占育龄期女性的1%～5%[2]。RSA常见病因包括遗传因素、免疫异常、内分泌紊乱、解剖异常等，但仍有部分患者不能确定其病因，即不明原因复发性流产[3]。

肾主生殖，胞胎系于肾。中医认为，脾肾两虚，胎元不固是RSA的基本病机。补肾安胎冲剂由寿胎丸化裁而来，具有补肾健脾、清热安胎功效，兼能益气养血。前期研究表明，补肾安胎冲剂可显著降低RSA发生率[4]。血管内皮生长因子（VEGF）与RSA密切相关，其可直接影响母胎界面血管生成，进而导致胚胎丢失[5-6]。课题组基于前期研究[7-10]，观察补肾安胎冲剂含药血清对RSA小鼠胎盘滋养细胞功能、VEGF及其受体VEGF-R1、VEGF-R2表达的影响，进一步探索补肾安胎冲剂治疗RSA的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1.1 动物

SPF级雌性CBA/J小鼠18只，6～7周龄，体质量（19±2）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0008。雄性DBA/2、BALB/c小鼠各5只，6～7周龄，体质量（19±2）g，SPF级雄性SD大鼠20只，6～7周龄，体质量（200±10）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于安徽中医药大学第一附属医院动物实验中心。本实验方案经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（AHUCM-rats-2021078）。

1.2 药物

补肾安胎冲剂由菟丝子10 g、桑寄生10 g、续断10 g、熟地黄10 g、黄芪20 g、白术10 g、党参10 g、黄芩10 g、白芍10 g、苎麻根10 g、墨旱莲15 g组成，本实验所用为液体制剂，购于安徽中医药大学第一附属医院，批号Z20200018000，每瓶120 mL（相当于原药材71 g）。

1.3 主要试剂与仪器

细胞周期检测试剂盒（货号BL114A），合肥Biosharp；
原代上皮细胞培养基（货号PriMed-iCell-001），阿联酋iCell；
胎牛血清（货号04-001-1ACS），合肥Biosharp；
PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（货号RR047A），日本TaKaRa；
荧光染料（货号E096-01B），苏州Novoprotein；
DEPC水（货号D1007），上海Generay Biotech；
VEGF抗体（货号bs-1313R）、VEGFR1抗体（货号bsm-52338R），北京Bioss；
VEGFR2抗体（货号ab39256），英国Abcam；
GAPDH抗体、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（货号分别为TA-08、ZB-2305、ZB-2301），北京中杉金桥。

流式细胞仪（型号CytoFLEX），美国BECKMAN公司；
荧光定量PCR仪（型号PIKOREAL 96），美国Thermo Scientific公司；
电泳仪（型号EPS300）、电泳槽（型号VE-180），上海天能科技有限公司；
普通PCR仪（型号K960），杭州晶格科学仪器有限公司；
低速迷你离心机（型号LX 300），海门市其林贝尔仪器制造有限公司；
高速台式冷冻离心机（型号JW-3021HR），安徽嘉文仪器装备有限公司；
微孔板迷你离心机（型号MINI-P25），杭州奥盛仪器有限公司；
超微量分光光度计（型号OD1000+），南京五义科技有限公司。

2.1 造模

参照Clark经典方法[11]，将雌性CBA/J小鼠分别与雄性DBA/2、BALB/c小鼠以2∶1合笼交配，得到RSA模型小鼠与正常妊娠小鼠，合笼后第2日开始每天清晨检查雌性小鼠阴道，见阴栓者计为妊娠第0日，否则继续合笼饲养。妊娠15 d后，称量小鼠体质量，颈椎脱臼处死，取出完整子宫，分离胎盘，置于-80 ℃冰箱保存。

2.2 胎盘滋养细胞分离培养

采用改良密度梯度离心法对原代胎盘滋养细胞进行分离，将得到的单细胞悬液用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

2.3 补肾安胎冲剂含药血清制备

SD大鼠随机分为空白血清组和含药血清组，每组10只，含药血清组以补肾安胎冲剂11.7 g/（kg·d）灌胃（按体表面积法计算，相当于成人等效剂量3倍），空白血清组予等量蒸馏水灌胃，灌胃体积0.2 mL/10 g，每日2次，连续7 d。末次灌胃2 h后，腹腔注射10%异戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉取血，3 000 r/min离心20 min，取上层血清，灭活，除菌，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 含药血清最佳浓度和作用时间筛选

将RSA小鼠胎盘滋养细胞以1.0×105个/mL接种于96孔培养板，每孔100 μL，将细胞分为对照组和1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%含药血清组，每组3个复孔，对照组加入20%空白血清，其余各组加入对应浓度的补肾安胎冲剂含药血清，同时设置空白组调零，置于培养箱分别培养12、24、48、72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL继续孵育4 h，酶标仪波长450 nm处测量各孔吸光度（OD值），计算细胞增殖活力。细胞增殖活力=（实验组OD值-空白组OD值）÷（对照组OD值-空白组OD值）。

2.5 细胞分组及给药

设置正常对照组（正常妊娠小鼠胎盘滋养细胞+20%空白血清）、模型组（RSA小鼠胎盘滋养细胞+20%空白血清）和补肾安胎冲剂组（RSA小鼠胎盘滋养细胞+20%补肾安胎冲剂含药血清），每组3个复孔，分别加入相应血清培养48 h后进行后续检测。

2.6 CCK8法检测细胞增殖活力

调整细胞密度为5×104个/mL，接种至96孔板，每孔100 μL，置于培养箱培养过夜，按“2.5”项下方法处理，采用CCK8法检测细胞增殖活力。

2.7 流式细胞术检测细胞周期

将细胞以1.0×106个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，置于培养箱培养过夜，按“2.5”项下方法处理，预冷PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化，2 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬洗涤后吸去上清，用预冷乙醇1 mL混匀，4 ℃固定，离心，弃上清，预冷PBS洗2次，离心，沉淀加入0.5 mL染色液（含25 μL碘化丙啶、10 μL RNaseA）重悬，混匀后置于37 ℃避光孵育0.5 h，流式细胞术检测各周期细胞百分数。

2.8 RT-qPCR检测

收集胎盘滋养细胞，Trizol法提取总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，将其作为荧光定量模板，进行PCR，反应条件：95 ℃预变性1 min；
95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot检测

收集胎盘滋养细胞，加入RIPA裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，按1∶4加入5×蛋白上样缓冲液，沸水浴加热、冷却至室温后，上样至加样孔，电泳、转膜后，Western洗涤液洗膜5 min，加5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、GAPDH一抗（均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PBST洗涤，加入二抗（1∶20 000），室温孵育2 h，洗膜，ECL曝光，凝胶成像系统成像，用Image J软件对条带进行分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

4.1 含药血清最佳浓度和作用时间筛选结果

当补肾安胎冲剂含药血清浓度为20%、作用时间48 h时，细胞增殖活力最高，其后随血清浓度、培养时间增加，细胞增殖活力有下降趋势，故选择20%含药血清培养48 h进行后续实验。见图1。

图1 补肾安胎冲剂含药血清最佳浓度和最佳作用时间筛选

4.2 补肾安胎冲剂对胎盘滋养细胞增殖活力的影响

与正常对照组比较，模型组胎盘滋养细胞增殖活力明显降低（P<0.05）；
与模型组比较，补肾安胎冲剂组胎盘滋养细胞增殖活力明显升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组胎盘滋养细胞增殖活力比较（±s）

表2 各组胎盘滋养细胞增殖活力比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05

组别正常对照组模型组补肾安胎冲剂组n 3 3 3增殖活力1.00±0.00 0.51±0.00*0.74±0.01#

4.3 补肾安胎冲剂对胎盘滋养细胞细胞周期的影响

与正常对照组比较，模型组胎盘滋养细胞S期细胞比例明显减少，G2/M期细胞比例明显增加（P<0.05）；
与模型组比较，补肾安胎冲剂组胎盘滋养细胞S期细胞比例明显增加，G2/M期细胞比例明显减少（P<0.05）。见表3。

表3 各组胎盘滋养细胞细胞周期比较（±s，%）

表3 各组胎盘滋养细胞细胞周期比较（±s，%）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05

组别正常对照组模型组补肾安胎冲剂组n 3 3 3 G0/G1期63.25±0.13 42.40±0.61*51.90±0.76#S期8.95±0.13 1.93±0.65*5.36±0.57#G2/M期27.80±0.18 55.67±0.05*42.74±0.26#

4.4 补肾安胎冲剂对胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表达的影响

与正常对照组比较，模型组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表达明显降低（P<0.05）；
与模型组比较，补肾安胎冲剂组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表达明显升高（P<0.05）。见表4。

表4 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表达比较（±s）

表4 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05

组别正常对照组模型组补肾安胎冲剂组n 9 9 9 VEGF 1.00±0.07 0.44±0.06*0.59±0.02#VEGF-R1 1.00±0.05 0.48±0.06*0.73±0.04#VEGF-R2 1.00±0.07 0.45±0.05*0.60±0.01#

4.5 补肾安胎冲剂对胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表达明显降低（P<0.05）；
与模型组比较，补肾安胎冲剂组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表达明显升高（P<0.05）。见图2、图3。

图2 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白免疫印迹

图3 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表达比较（±s，n=3）

RSA是目前生殖医学领域的研究热点，中医药治疗RSA具有明显优势[12]。补肾安胎冲剂为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，以肾主生殖、胞胎系于肾为理论依据，由安胎名方寿胎丸化裁而来。方中君药菟丝子、党参先后天并补，菟丝子补肾益精，肾旺自可荫胎，党参补气益血，且能健脾生津；
熟地黄补肾填精益髓，加强补肾之功，续断、桑寄生补肝肾、强筋骨、固冲任，白术、黄芪健脾益气，以上共为臣药；
白芍养血调经、敛阴柔肝，墨旱莲凉血止血、补益肝肾，黄芩、苎麻根清热安胎，以防滋腻太过，为佐使药。全方共奏补肾健脾、清热安胎之功。该方治疗RSA临床效果显著[4]，但其作用靶点与机制尚未完全阐明。

胎盘滋养细胞增殖和凋亡的动态平衡有益于妊娠的维持，病理妊娠的发生多与胎盘滋养细胞异常相关[13]。本研究CCK8检测发现，补肾安胎冲剂含药血清能明显增强RSA小鼠胎盘滋养细胞增殖活力，且在一定范围内随着含药血清浓度增加及给药时间延长作用增强。流式细胞术检测结果表明，与正常对照组相比，模型组胎盘滋养细胞S期（DNA合成期）细胞比例显著下降，细胞多停滞于G2/M期（P<0.05），而补肾安胎冲剂含药血清干预后，S期细胞比例显著升高，G2/M期细胞比例显著下降（P<0.05），提示补肾安胎冲剂可促进胎盘滋养细胞DNA合成，使细胞通过G2/M间期，促进细胞活跃增殖。

研究发现，妊娠的不良结局与母胎界面血管形成异常相关[14]，蜕膜组织VEGF表达水平直接影响早期自然流产的妊娠结局。VEGF具有增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖、迁移等作用，通过与跨膜受体VEGF-R1、VEGF-R2等结合在胎盘及其功能形成过程中发挥至关重要的作用[5]。Bagheri等[15]研究表明，与健康非妊娠及健康妊娠者相比，RSA非妊娠患者体内VEGF-A和VEGF-C表达明显降低，且与年龄、体质量指数及流产次数呈负相关，并指出VEGF-A、VEGF-C低表达与RSA易感性之间密切关联，可将其作为URSA患者流产发生的预测标志物。李伟莉等[16]用补肾安胎冲剂治疗RSA患者，分别于治疗前后检测患者血清VEGF及可溶性受体-1（sFlt-1）表达，发现可使VEGF表达升高，sFlt-1表达降低，从而促进胎盘血管新生。有研究表明，VEGF表达下降可能对胎盘滋养细胞增殖、凋亡造成不利影响[17]。本研究结果表明，与正常对照组相比，模型组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表达均明显降低（P<0.05），而补肾安胎冲剂含药血清干预后，胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表达均明显升高（P<0.05），表明补肾安胎冲剂可上调VEGF及其受体VEGF-R1、VEGF-R2表达，介导母胎界面血管新生，提高妊娠成功率。

综上所述，补肾安胎冲剂含药血清能明显增强RSA小鼠胎盘滋养细胞增殖活力，同时显著上调VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表达，促进胎盘滋养细胞血管新生。

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