我国不同利用方式土壤四环素类抗性基因积累的研究

龚小雅，宋建宇，吴凤芝

（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030）

农田土壤中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）外源输入的主要方式是污水与再生水的灌溉[1]以及畜禽粪便作为有机肥的施用[2]。目前污水处理系统可去除氨氮和总磷等物质，但无法有效去除高浓度的ARGs，从而使得农田灌溉再生水中ARGs 浓度较高[3]。此外，应用于畜牧养殖业的抗生素有90%不能被动物肠道吸收，其会以原形或者代谢物的形式随动物粪便排出体外[4]，因此，畜禽粪便中积蓄着大量ARGs，随着有机肥替代化肥农业技术的推行[5]，畜禽粪便以有机堆肥的形式广泛施用于农田。ARGs从再生水和有机堆肥这两种“源”通过灌溉和施用的方式输入到农田土壤的“库”[6-7]，导致大量ARGs 在农田土壤积累[8]，这些ARGs 通过受污染作物和地下水系统重新进入食物链，对人体健康造成危害[9-10]。因此，探讨土壤中抗生素抗性基因绝对丰度的变化，以此揭示抗性基因在土壤中的积累情况具有重要意义。

影响ARGs 积累的因素包括气候、土壤空间属性、有机肥来源和用量[11]。长三角红壤农田土壤中总ARGs相对丰度范围为2.26×10-4～1.16×10-1[12]，东北黑土地区农田土壤中总ARGs 绝对丰度范围是2.59×107～1.14×108copies·g-1[13]。还有研究发现，施用畜禽粪便的农业土壤中ARGs 的水平显著提高[14-15]，其中，设施菜田土壤ARGs 的种类和丰度高于农田土壤[16]，施加有机肥的农田土壤ARGs 数量和丰度显著高于施加化肥的农田土壤，并在施肥10 a 后ARGs 数量显著增加[11]。研究表明，在水稻田施用畜禽粪便几十年后，土壤中ARGs 的丰度较未施用畜禽粪便的稻田显著增加[17]，因此，土壤ARGs的积累量随着年份的增加出现累加效应。

在农田土壤中，几乎所有类别的ARGs 均显著增加，尤其是四环素类（Tetracyclines）抗生素抗性基因增加最多[18]。四环素类抗生素抗性基因是一种新型的环境污染物[19-20]，在银川、重庆和沈阳的设施菜地和露地中均有检出，且设施菜地的四环素类抗生素抗性基因含量显著高于露地[21-22]。四环素类抗性基因已经广泛存在于农田土壤中[23]，但对于四环素类抗生素抗性基因的探究多集中于狭窄范围的农田土壤中的积累和迁移，其结果依赖于特定的实验地点和条件，其结果虽有同一性，但因土壤利用方式和利用年限的差异，各地土壤无法进行比较，对全国各地四环素类抗生素抗性基因积累情况的判定也仍有较大偏差，对广泛地理范围下不同农业土地利用方式和不同年限土壤抗生素积累的研究远远不够。因此，本研究利用普通PCR 和qPCR 荧光定量技术，对不同地区、不同利用年限下的设施、露地菜田和粮田土壤中抗性基因绝对丰度进行研究，明确不同利用方式以及不同年限的土壤中抗性基因积累特征，为农业安全生产提供参考。

试验土壤样品中抗生素抗性基因的检测在东北农业大学园艺园林学院农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室完成。

1.1 试验材料

试验土壤于2017 年7—8 月取自我国黑龙江（HLJ）、吉林（JL）、辽宁（LN）、内蒙古（NMG）、新疆（XJ）、甘肃（GS）、云南（YN）、江苏（JS）、湖北（HB）、广东（GD）、海南（HN）、山西（SX）、河南（HEN）、山东（SD）共计14 个省份具有代表性的不同种植年限（1～3、7～10 a 和15 a 以上）和不同土地利用方式（设施菜田、露地菜田和露地粮田）的土壤，取土深度为去除表面土壤后的5～20 cm。每个省份选取设施菜田（S）、露地菜田（L）和露地粮田（D）3种不同土地利用方式和3个种植年限的9种土壤作为研究对象，即9个处理。根据具体取样地点的气候环境以及我国土地资源的划分情况将14 个取样地区又划分为5 个地区[24-25]，即黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古划分为北部地区，甘肃和新疆划分为西部地区，江苏和湖北划分为长江地区，山西、河南和山东划分为中部地区，海南和云南划分为南部地区。

1.2 样品采集与处理

选取14 个地区不同种植年限的典型温室蔬菜田（1～3、7～10 a、＞15 a）、邻近温室的露地菜田以及粮田，在每种利用方式处采用5 点取样法采集深度为5～20 cm 的耕层土壤，土样过2 mm 筛，去除样品中的残根、植株残体和石块等杂质，每5 点混合为一个土样，作为一次重复，重复3 次，共计378 个（14 个地区×3 种土壤利用方式×3 种使用年限×3 次重复）土壤样品。将土样放入无菌自封袋中，带回实验室于-80 ℃冰箱中保存，用于提取土壤DNA。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤总DNA的提取

取0.25 g 土壤样品，用Power Soil®DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，美国）按说明提取DNA。每个土壤样品平行提取3 次，提取的溶液混合后待用。用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取土壤中的DNA。使用NanoDropND-1000 UV-Vis 分光光度计（Thermo Scientific，Rockwood，TN，美国）检测提取物的DNA浓度和质量（A260/A280）。

1.3.2 普通PCR定性和qPCR定量分析

本研究选择了4种四环素类抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）进行定性PCR 检测。在IQ5 实时PCR 系统（Bio-Rad Lab，LA，美国）中测定4 种四环素类抗性基因的丰度。所用引物设计主要来源于已发表的文献[26-29]，引物序列及目标基因片段大小如表1 所示。引物由迈浦生物科技公司（Map Bio，上海）设计。

表1 四环素类抗性基因引物序列Table 1 Primers of tet resistance genes

普通PCR 定性检测的反应体系为25 μL，包括12.5 μL Taq PCR Master Mix，10.5 μL 无菌去离子水，0.5 μL 上游引物（10 μmol·L-1），0.5 μL 下游引物（10 μmol·L-1）和1 μL 模板DNA。普通PCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火延伸30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；
72 ℃延伸10 min。

qPCR 定量检测的反应体系为10 μL，主要包括5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix，3.0 μL 无菌去离子水，0.5 μL上游引物（10 μmol·L-1），0.5 μL下游引物（10 μmol·L-1）和1 μL 模板DNA。qPCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；
94 ℃变性20 s，T℃退火30 s（表2），72 ℃延伸30 s，40个循环；
72 ℃延伸7 min。溶解曲线在65 ℃至95 ℃之间，每5 s增加0.5 ℃，期间停留30 s。

表2 qPCR 的退火温度Table 2 qPCR annealing temperature

1.4 数据分析

采用Excel 2010 进行数据处理，采用SPSS（Version 19.0）对试验的原始数据进行差异显著性分析，使用Graphpad Prism 7绘图。不同省份同一利用方式和同一年限土壤中四环素类抗性基因绝对丰度的差异分析，以14 个省份作为方差的分析因素，通过单因素方差实现。箱线图分析采用R 软件ggplot2 包，线性回归分析采用R软件ggplot2和ggsci包[30]。

2.1 不同土壤中抗性基因的定性检测

在14 个省份的1～3（以3 a 表示）、7～10 a（以7 a表示）和15 a 以上（以15 a 表示）的设施菜田土壤、露地菜田土壤和露地粮田土壤中四环素类抗性基因的检出率均为100%（表3）。

表3 不同地区土壤中四环素类抗性基因的检出情况Table 3 Detection of tet in soil from different areas

2.2 同一利用方式下不同年限土壤四环素类抗性基因差异分析

2.2.1tetM绝对丰度差异分析

粮田土壤中的绝对丰度范围为1.60×104～1.95×106copies·g-1，3、7 a 和15 a 露地粮田土壤中tetM绝对丰度均在黑龙江地区最高，在河南地区最低（图1a）。露地菜田土壤中的丰度范围是9.98×104～5.97×106copies·g-1，3、7 a 和15 a 露地菜田土壤中丰度均在黑龙江地区最高，均在湖北地区最低（图1b）。设施菜田土壤中的丰度范围是3.45×105～1.04×107copies·g-1，3、7 a 和15 a 设施菜田土壤中丰度均在黑龙江地区最高，3 a设施菜田土壤中为海南地区最低，7 a为河南地区最低，15 a为湖北地区最低（图1c）。tetM的绝对丰度在黑龙江地区的15 a设施菜田土壤中最高，在河南地区的15 a粮田土壤中最低。

图1 不同地区同一利用方式土壤中tetM绝对丰度的差异Figure 1 Difference of absolute abundance of tetM in soils with the same utilization pattern in different area

2.2.2tetO绝对丰度差异分析

粮田土壤中绝对丰度范围是1.11×105～2.18×106copies·g-1，在3、7 a和15 a粮田土壤中tetO的绝对丰度均在江苏地区最高，均在辽宁地区最低（图2a）。露地菜田土壤中丰度范围为3.79×105～2.48×107copies·g-1，3、7 a和15 a露地菜田土壤中丰度均在黑龙江地区最高，均在甘肃地区最低（图2b）。设施菜田土壤中丰度范围为1.76×106～6.36×107copies·g-1，3、7 a 和15 a设施菜田土壤中丰度均在黑龙江地区最高，均在甘肃地区最低（图2c）。tetO的绝对丰度在黑龙江地区的15 a 设施菜田土壤中最高，在辽宁地区的7 a 粮田土壤中最低。

图2 不同地区同一利用方式土壤中tetO绝对丰度的差异Figure 2 Difference of absolute abundance of tetO in soils with the same utilization pattern in different area

2.2.3tetQ绝对丰度差异分析

在粮田土壤中tetQ的绝对丰度范围为5.25×103～2.40×105copies·g-1，3、7 a 和15 a粮田土壤中绝对丰度最高地区均为黑龙江地区，最低均为湖北地区（图3a）。露地菜田土壤中丰度范围为1.16×104～6.64×105copies·g-1，3 a 露地菜田土壤中丰度最高地区为黑龙江地区，7 a为广东地区，15 a为甘肃地区，3、7 a和15 a露地菜田土壤中丰度最低地区均为湖北地区（图3b）。设施菜田土壤中丰度范围为3.96×104～3.71×106copies·g-1，黑龙江地区的3 a 和7 a 设施菜田土壤tetQ的丰度均最高，15 a 为甘肃地区，3、7 a 和15 a 设施菜田土壤中湖北地区的丰度显著低于其他地区（图3c）。tetQ的绝对丰度在甘肃地区的15 a设施菜田土壤中最高，在湖北地区的15 a粮田土壤中最低。

图3 不同地区同一利用方式土壤中tetQ绝对丰度的差异Figure 3 Difference of absolute abundance of tetQ in soils with the same utilization pattern in different area

2.2.4tetW绝对丰度差异分析

在粮田土壤中tetW的绝对丰度范围为2.16×103～1.64×105copies·g-1，3 a粮田土壤中绝对丰度最高地区为云南地区，7 a和15 a为海南地区，3、7 a和15 a粮田土壤中绝对丰度最低地区均为新疆地区（图4a）。露地菜田土壤丰度范围为1.32×104～8.00×105copies·g-1，3 a和7 a露地菜田土壤中丰度最高地区为广东地区，15 a为黑龙江地区，3、7 a和15 a露地菜田土壤中丰度最低地区均为新疆地区（图4b）。设施菜田土壤中丰度范围为6.07×104～2.74×106copies·g-1，3 a 和7 a 设施菜田土壤丰度最高均为黑龙江地区，15 a为吉林地区，3 a设施菜田土壤丰度最低地区为江苏地区，7 a和15 a为新疆地区（图4c）。tetW的绝对丰度在吉林地区的15 a设施菜田土壤中最高，在新疆地区的3 a粮田土壤中最低。

综上，四环素类抗性基因的绝对丰度范围是2.16×103～6.36×107copies·g-1，tetM和tetQ中都有9个地区是15 a以上设施菜田的丰度最高。tetO和tetW中都有10个地区是15 a以上设施菜田的丰度最高，丰度最低的均在粮田土壤中，四环素类抗生素抗性基因丰度在15 a以上设施菜田最高的比例为67.9%（图1～图4）。

图4 不同地区同一利用方式土壤中tetW绝对丰度的差异Figure 4 Difference of absolute abundance of tetW in soils with the same utilization pattern in different area

2.3 同一地区与同一利用年限下不同利用方式四环素类抗生素抗性基因差异分析

2.3.1tetM差异分析

北部地区设施菜田土壤的tetM绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，且露地菜田显著高于露地粮田土壤（图5a）。长江、南部、西部和中部地区设施菜田土壤的tetM绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地粮田土壤间无显著差异（图5b～图5e）。

图5 北部、西部、长江、中部和南部地区不同利用方式土壤中tetM的差异Figure 5 Differences of tetM in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.3.2tetO差异分析

北部、南部和中部地区设施菜田土壤的tetO绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，且露地菜田显著高于露地粮田土壤（图6a、图6c 和图6e）。长江和西部地区设施菜田土壤的tetO绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地粮田土壤间无显著差异（图6b和图6d）。

图6 北部、西部、长江、中部和南部地区不同利用方式土壤中tetO的差异Figure 6 Differences of tetO in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.3.3tetQ差异分析

北部和南部地区设施菜田土壤的tetQ绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，且露地菜田显著高于露地粮田土壤（图7a 和图7c）。长江、西部和中部地区设施菜田土壤的tetQ绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地粮田土壤间无显著差异（图7b、图7d和图7e）。

图7 北部、西部、长江、中部和南部地区不同利用方式土壤中tetQ的差异Figure 7 Differences of tetQ in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.3.4tetW差异分析

北部、南部和中部地区设施菜田土壤的tetW绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，且露地菜田显著高于露地粮田土壤（图8a、图8c 和图8e）。长江和西部地区设施菜田土壤的tetW绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地粮田土壤间无显著差异（图8b和图8d）。

图8 北部、西部、长江、中部和南部地区不同利用方式土壤中tetW的差异Figure 8 Differences of tetW in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.4 不同利用方式下土壤四环素类抗性基因与利用年限的线性分析

设施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW基因与土壤利用年限呈显著线性正相关关系（图9），而露地粮田和露地菜田土壤的4 个四环素类抗性基因与土壤利用年限无显著线性相关。

图9 四环素类抗性相关基因与利用年限的线性回归Figure 9 Linear regression between tetracycline resistance genes and soil planting life

施用有机肥能够增加土壤中抗生素抗性基因的丰度，并带入土壤中本没有的抗生素抗性基因[18，31-32]。本研究选取了在土壤环境中经常被检出的4 种四环素类抗生素抗性基因（tetM、tetO、tetQ和tetW）作为本试验的目标基因，对其存在情况进行PCR 检测，从来自14 个省份的土壤中均检出了上述基因，这一结果与前人研究基本一致[33]。这可能是由于携带不同抗生素抗性基因的移动遗传元件广泛存在，且参与抗生素抗性基因的扩散[34]，tet基因的宿主范围广，更容易在土壤中传播[35]。这也意味着四环素类抗性基因已经广泛分布于不同类型的农用土壤中，具备潜在土壤和环境污染风险。抗生素的肆意滥用使抗性基因通过多种途径传播进入到环境中，并通过食物链循环等因素进入人体，从而产生危害[36-37]。

由于我国不同省份的蔬菜播种面积明显不同[33，38]，施肥量的差异[39]和土壤特性的区域差异[40]都会导致不同地区抗生素抗性基因有很大差异[36]。在本试验中，14个地区3种不同利用方式下土壤中四环素类抗生素抗性基因存在显著差异，但是均表现为设施菜田土壤中各抗性基因的绝对丰度显著高于相同年限下粮田和露地菜田土壤。粮田和露地菜田土壤中大量施用化肥，而设施菜田多施用有机肥[41]，这可能导致其土壤中抗生素的污染程度加剧，大量的抗生素抗性基因积累[6-7]。北部、西部、长江、中部和南部地区设施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ、tetW均高于露地菜田和露地粮田土壤。一方面，设施菜田与露地菜田和粮田相比，具有很好的种植优势，设施菜田每年可以种植多茬作物，因此施用有机肥的次数增多，从而导致设施菜田土壤中抗生素抗性基因的绝对定量值高于露地菜田和粮田土壤[36]；
另一方面，相对于露地菜田和粮田，设施菜田属于相对封闭的环境，不受外界因素的影响，从而有利于抗性的积累，这也可能是设施菜田土壤中四环素类抗性基因的绝对丰度高于露地菜田和粮田土壤的原因[42]。从本试验结果来看，各地区土壤中四环素类抗生素抗性基因的绝对丰度存在显著差异。栽培方式也是影响抗性基因污染程度的因素之一[40]。抗生素抗性基因独特的空间分布格局可能受土壤共存污染物、土壤特性和天气条件的区域性差异的影响[42]。因此我国不同地区ARGs的污染水平不同主要是由于人类活动、土壤类型和天气条件所造成的[43]。

本试验的研究结果表明，四环素类抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）的绝对丰度在设施菜田3 a 的土壤中显著低于设施菜田7 a和15 a的土壤，可见，其抗性基因会随土壤利用年限的增加而在土壤环境中积累，这与前人的研究结果一致[44]。长期的粪便施用会使土壤中养分含量显著提升，从而提高土壤中微生物的数量[45]。本课题组利用本试验土壤测定土壤养分，发现设施菜田3 a的土壤中的养分含量显著低于设施菜田7 a 和15 a 的土壤[46]。随着宿主细菌多样性的增加和细菌间遗传物质的交换，无论是来自共生菌群间还是来自于外界环境的潜在抗生素抗性基因，均能够增加土壤微生物区系对抗生素的抵抗能力，随之使抗生素抗性基因丰度显著提升[47]。因此，造成本试验结果的原因可能是设施菜田3、7 a和15 a土壤中微生物的数量不同，导致微生物区系对抗生素的抵抗能力不同，使得抗生素抗性基因的丰度存在差异。

将14个省份分为5个地区，发现北部和南部地区的设施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW的绝对丰度显著高于露地菜田和露地粮田土壤，同时露地菜田显著高于露地粮田土壤，西部、长江和中部地区设施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ的绝对丰度显著高于露地菜田和露地粮田土壤，但露地菜田和露地粮田土壤间无显著差异。土壤的空间属性成为最可能影响抗生素抗性基因积累的因素[11]。对相同土壤进行微生物区系分析，发现土壤pH 的降低导致细菌群落的随机聚集[48]，促使土壤环境中抗生素抗性基因的积累和传播，土壤酸度对土壤中抗生素的吸附和解吸行为具有重要作用[49]，因此，不同地区的土壤性质也会影响抗性基因丰度。

此外，对不同利用方式下土壤中4 个四环素类抗性基因与土壤农作年限进行线性分析，发现设施菜田土壤中tetO、tetQ、tetW基因的绝对丰度随土壤利用年限的增加而积累，但露地菜田和粮田土壤的抗生素不存在这种线性关系。这一方面反映了土地利用方式影响四环素类抗性基因的积累，露地菜田和粮田土壤抗性基因独特的空间分布格局可能受土壤共存污染物、土壤特性和天气条件的区域性差异的影响[42]，因此，受年限的影响不显著。另一方面，由于设施菜田受到更少的外界因素影响，四环素类抗性基因表现为逐年积累的趋势，在设施菜田内更容易探究抗生素积累污染情况与年限的关系。

（1）粮田、露地菜田和设施菜田土壤中四环素类抗性基因（tetM、tetO、tetQ和tetW）的检出频率均为100%。

（2）tetM、tetO、tetQ和tetW在设施菜田土壤中的绝对丰度均显著高于粮田和露地菜田土壤。各地区3、7 a和15 a的设施菜田土壤均显著高于相同年限下的粮田和露地菜田土壤，且设施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW基因与年限存在显著正相关关系。

（3）设施菜田抗生素抗性基因总体上随年限增加呈累积趋势，不同年限的露地菜田间以及粮田土壤间均无显著差异。

（4）北部、西部、长江、中部和南部地区设施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ、tetW的绝对丰度显著高于露地菜田和露地粮田土壤，北部和南部地区的设施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW的绝对丰度显著高于露地菜田和露地粮田土壤，同时露地菜田显著高于露地粮田土壤，西部、长江和中部地区设施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ的绝对丰度显著高于露地菜田和露地粮田土壤，但露地菜田和露地粮田土壤间无显著差异。

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