马铁菊头蝠在西藏首次发现

何敏怡， 邓汶圃， 李彦男， 谢慧娴， 梁晓玲， 岳阳， 吴毅 ， 余文华

（广州大学生命科学学院，华南生物多样性保护与利用重点实验室，广州510006）

翼手目Chiroptera是哺乳动物中第二大类群，也是唯一真正适应飞翔的哺乳动物（Wilson &Reeder，2005），目前记录有 18科 202属 1 401种（Wilson & Mittermeier，2019），我国有 8科 36属140种，其中菊头蝠科Rhinolophidae菊头蝠属Rhinolophus19种（魏辅文等，2021）。该类群一般栖息于热带、亚热带和温带地区，为洞穴型常见种类，以昆虫为食，是生态系统中重要的成员之一（吴毅等，1997；
Csorbaet al.，2003；
张成菊，吴毅，2006）。

马铁菊头蝠R. ferrumequinum于1774年由Schreber命名，分布遍及非洲北部、欧洲南部和亚洲南部（Csorbaet al.，2003；
Wilson & Mittermeier，2019）。根据形态和分子遗传学的差异划分为不同亚种，如指名亚种R. f. ferrumequinum、日本亚种R. f. nippon和尼泊尔亚种R. f. tragatus等（Corbet，1978；
Oscar，1995；
Benda & Vallo，2012）。在中国，一般认为分布有2个亚种：尼泊尔亚种，分布于云南和贵州；
日本亚种，分布于吉林、辽宁、河北和北京等地（王应祥，2003）。本研究组在西藏自治区错那县与墨脱县开展翼手目物种多样性调查时，使用蝙蝠竖琴网采集到4只菊头蝠，经形态学和分子系统学分析，鉴定为马铁菊头蝠。

1.1 标本采集

2019年7月5日在西藏自治区错那县（91°47′52″E，27°53′42″N，海拔3 108 m）使用蝙蝠竖琴网采集到 3只菊头蝠（1♂：GZHU 19422，2♀：GZHU 19423和GZHU 19424）；
2021年7月27日在西藏自治区墨脱县（95°19′8.8″E，29°18′49.8″N，海拔1 263 m）采集到1只菊头蝠（1♀：GZHU 21206）。以上标本均保存于广州大学华南生物多样性保护与利用重点实验室。

1.2 形态测量

按照哺乳动物测量标准（杨奇森等，2007），使用数显游标卡尺（MNT-150，上海美耐特实业有限公司；
精度0.01 mm）对外形和头骨进行测量，电子数字天平（i2000，永康市艾瑞贸易有限公司；
精度0.1 g）称量体质量。外形测量指标包括：体质量（body mass，MASS）、头体长（head and body length，HB）、前臂长（forearm length，FA）、胫骨长（tibia length，TIB）、尾长（tail length，TL）、耳长（ear length，E）和后足长（hindfoot length，HF）。头骨测量指标包括：颅全长（greatest length of skull，GTL）、颅基长（condylobasal length，CBL）、枕犬长（condylo-canine length，CCL）、腭长（palatal length，PL）、脑颅宽（breadth of braincase，BB）、后头宽（mastoid width，MW）、颧宽（zygomatic width，ZW）、眶间距（interorbital width，IOW）、上齿列长（maxillary tooth length，C1-M3L）、上犬齿宽（upper canine width，C1-C1W）、上臼齿宽（maxillary third molar width，M3-M3W）、下齿列长（mandibular toothrow length，C1-M3L）、下颌长（mandibular length，ML）、下颌高（mandibular height，MH）。

1.3 DNA提取与扩增

取约20 mg肝脏或肌肉组织，使用DNA试剂盒（AG通用型基因组AG21009，艾科瑞生物）提取样品总DNA。在PRIMER 3（Koressaaret al.，2018）中设计引物cyt b-F：5’-CCGCCCCATCAAGTATCTCT-3’和cyt b-R：5’-GCGATGCTTGCAAGTGGTAT-3’扩增cyt b基因；
PCR反应总体系为 30 μL：Premix TaqTM15 μL，引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 13 μL；
PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 45 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1 min，48个循环；
72 ℃ 10 min，4 ℃保存。应用引物（Bakeret al.，2000）Rag2-F1：5’-GGCYG GCCCAARAGATCCTG-3’；
Rag2-R1：5’-AACYTG YTTATTGTCTCCTGGTATGC-3’扩增Rag2基 因，PCR反应总体系为 25 μL：Premix TaqTM12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL；
PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 30 s，62.5 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，35个循环；
72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物送至上海生工生物工程公司进行测序。

1.4 系统发育学分析

采用 GENEIOUS 9.1.8（Drummondet al.，2016）对测序结果进行人工拼接与校对。从NCBI-nt数据库中下载已有菊头蝠属物种的cyt b和Rag2基因部分序列用于后续分析，将大蹄蝠Hipposideros armiger和中蹄蝠H. larvatus基因序列设置为外群（表1），使用MUSCLE（Edgar，2004）对序列矩阵进行排序比对。应用MrModelTest 2.4（Nylander，2004）明确最佳核苷酸替换模型为GTR+I+G（cyt b）和 HKY+G（Rag2）。

MrBayes 3.2（Ronquistet al.，2012）分别构建贝叶斯树，设置总抽样代数为2 000万代，抽样频率为1 000，丢弃前25%数据。

表1 用于菊头蝠属系统发育树构建的cyt b基因序列号Table 1 Sequences of cyt b gene used in phylogenetic analysis of genus Rhinolophus

2.1 形态学特征

本研究的标本体型较大，体质量17.4～21.8 g，头体长 56.45～66.61 mm，前臂长 60.13～63.04 mm（表2）。体毛细密柔软，背毛棕褐色，腹毛浅棕色。耳壳大且宽阔，尖端稍尖窄，具有对耳屏。正面及侧面观察头部前端具发达的鼻叶（图1：A，B），顶叶近三角形；
中间突出部分为鞍状叶和联接叶，鞍状叶两侧向中部微凹，呈提琴状，鞍状叶和联接叶几乎等高，“T”型连接处有一小凹陷；
马蹄叶宽圆。头骨狭长（图1：C～E），颅全长25.36～26.11 mm，矢状嵴发达，人字嵴明显，鼻隆近圆形，眶间距狭窄，颧弓发达，颧宽12.75～13.26 mm。齿式为1.1.2.3/2.1.2.3=30，上颌门齿较小，几乎不见（图1：C），上下犬齿（C）发达，上颌第一前臼齿（P2）极小（图1：G）位于上犬齿和第二上前臼齿（P4）连接处外侧或缺失（图1：H）；
下门齿的齿冠都具有3个尖端（图1：F），第一下前臼齿（P2）小于第二下前臼齿（P4），下臼齿齿冠“W”型，且后侧“V”型齿尖略低于前侧。

图1 西藏地区马铁菊头蝠外部形态和头骨特征Fig. 1 External and craniodental characteristics of Rhinolophus ferrumequinum from Tibet， China

表2 马铁菊头蝠的外形及头骨特征比较Table 2 Comparison of external and craniodental measurements of Rhinolophus ferrumequinum

2.2 系统发育分析

基于982 bp线粒体基因cyt b和683 bp核基因Rag2部分序列构建的系统发育树显示：本研究序列分别与从NCBI-nt数据库中下载的马铁菊头蝠序列聚为高支持度的一支，后验概率分别为0.99（图2：A）和0.97（图2：B），且基于cyt b基因的贝叶斯树显示，本研究标本与欧洲地区（保加利亚、西班牙、斯洛伐克）马铁菊头蝠指名亚种具有一定差异。另外，本研究标本与印度尼西亚和中国地区（贵州、江西、云南）的中菊头蝠R. affinis位于不同分支。

在形态上，马铁菊头蝠与中菊头蝠鼻叶结构相似，但在体型及遗传上存在差异，中菊头蝠体型比较小：马铁菊头蝠前臂长一般大于56 mm，中菊头蝠则小于56 mm（刘延德等，2006；
Smith，解焱，2009；
刘少英等，2020）。本研究标本的前臂长均大于56 mm（表2）；
系统发育分析结果显示，该批标本与中菊头蝠处于不同分支，且与马铁菊头蝠聚为一支（图2）。因此，外部形态和分子结果均提示为马铁菊头蝠。

图2 基于cyt b （A）和Rag2 （B）基因构建的菊头蝠属Rhinolophus贝叶斯树Fig. 2 Bayesian trees of genus Rhinolophus based on cyt b （A） and Rag2 （B）genes

在外形和头骨特征上，本研究标本的头体长、胫骨长和上齿列长均与四川和贵州标本基本吻合，前臂长、尾长、颅全长、颧宽、眶间距稍大于四川和贵州标本，而耳长、脑颅宽小于四川和贵州标本（表2）。本研究标本前臂长（67.70 mm vs.贵州56.32 mm）和颅全长（25.85 mm vs.四川23.67 mm）等与四川和贵州的标本存在一定差异，但该差异是否源于遗传差异或标本量不足仍有待核实。同时，本研究中的部分标本（GZHU 19422和GZHU 19424）上颌第一前臼齿缺失，与Csorba等（2003）报道的一致。

基于cyt b基因构建的贝叶斯树显示，本研究序列与NCBI-nt数据库中的马铁菊头蝠序列聚为一支的支持度较高，后验概率为0.99，然而亚洲地区（中国吉林、河南、云南和日本、韩国）的马铁菊头蝠单系性存疑（支持度较低，后验概率为0.76）。由于该系统发生树为单基因树，因此有待进一步增加分子标记来探讨该拓扑关系和开展更为细致的亲缘地理学分析。

马铁菊头蝠主要分布于欧洲南部、非洲北部、大多数地中海地区和东南亚地区，在中国分布有日本亚种和尼泊尔亚种（王应祥，2003），由于样本量和数据的局限性，本研究难以明确西藏标本的亚种归属。值得注意的是，Wilson和Mittermeier（2019）将马铁菊头蝠日本亚种提升为种，即日本马铁菊头蝠R. nippon，其内设置2个亚种，即指名亚种和尼泊尔亚种。由于该分类设置仍有待基因组学及其他证据的核实，故本研究采用魏辅文等（2021）的分类设置，但不排除后续学名变动的可能。

马铁菊头蝠为广布种，迄今为止，在中国记录于云南、贵州、吉林、辽宁、河北、北京、河南、山东、山西、江苏、上海、浙江、安徽、福建、湖南、广西、四川、湖北、陕西、甘肃、宁夏、江西、重庆（王应祥，2003；
Smith & 解焱，2009；
蒋志刚等，2015）。本次马铁菊头蝠在西藏自治区的发现为该区域翼手目分布新记录，丰富了西藏地区哺乳动物物种多样性，为西藏野生动物管理部门提供了基础生物学数据。

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